O reagente de transfecção PEI 25000 de polietilenoimina linearizada é um polímero catiônico altamente carregado que se liga facilmente a moléculas de ácido nucleico carregadas negativamente, forma um complexo e permite que o complexo entre na célula. O reagente de transfecção é um reagente de transfecção transitório com baixa citotoxicidade, alta eficiência de transfecção e alta eficiência de expressão gênica em células como HEK293 e CHO. Foi verificado que o reagente de transfecção PEI linear é amplamente aplicável a uma variedade de linhagens celulares, incluindo células HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 e Hela, etc. O reagente é compatível com meios contendo soro e pode introduzir ácidos nucleicos nas células de forma eficiente.

Especificação

Envio e armazenamento

O produto é enviado em temperatura ambiente e o pó pode ser armazenado a 2-8 ºC por dois anos. A solução estoque é armazenada a 2-8 ºC por 3 meses.

Cuidados


1) Após a solução de PEI preparada ser retirada de -20 ºC e descongelada, ela pode ser armazenada em refrigerador a 4 ºC e não deve ser congelada novamente.

2) Para a maioria das células, 3,0 μL de reagente de transfecção PEI por 1 μg de DNA podem atingir alta eficiência de transfecção. Você também pode tentar usar um volume de 1,5~4 μL de reagente de transfecção PEI linear por 1 μg de DNA para otimização.

3) Para sua segurança e saúde, use jaleco, luvas descartáveis ​​e capela de exaustão durante a operação.

4) Este produto é apenas para fins de pesquisa científica, não para uso humano.

Preparação da solução estoque (1 mg/mL)


1. Materiais

PEI 25000, água Milli-Q®/água para injeção (WFI) ou água de qualidade biológica similar, ácido clorídrico (HCl) 12 mol/L, hidróxido de sódio (NaOH) 10 mol/L, filtro estéril a vácuo PES descartável de 0,1~0,2 μm, frasco de armazenamento estéril de HDPE ou polipropileno.

2. Preparar solução estoque (1 mg/mL)

1) Em um béquer de vidro de 1 L, adicione 1 g de pó PEI 25000 em 900 mL de água ultrapura Milli-Q® ou outra água biológica equivalente e agite uniformemente em um agitador magnético para produzir um pequeno vórtice.

2) Adicione ácido clorídrico (12 mol/L) gota a gota, mexendo sempre para ajustar o pH até pH<2,0.

3) Cubra a parte superior do béquer e agite por 3 horas até dissolver completamente; mantenha o pH < 2,0 durante todo o processo.

【Observação】: Pode haver algumas pequenas partículas fibrosas que não podem ser dissolvidas, o que é um fenômeno normal.

4) Adicione NaOH (10 mol/L) gota a gota, mexendo sempre para ajustar o pH até atingir 6,9 ~7,1.

5) Transfira a solução para uma proveta graduada e adicione água até completar 1 L.

6) Filtrar e esterilizar com um filtro a vácuo PES descartável de 0,1-0,2 µm para obter uma solução estoque de 1 mg/mL.

7) Aliquote conforme necessário e armazene a -20 °C, estável por 1 ano.

【Observação】: Após descongelar novamente a solução de armazenamento, ela pode ser armazenada a 4 °C e é estável por 2 semanas, mas não deve ser congelada novamente.

Procedimento de transfecção (tomando como exemplo uma placa de 6 poços)


1. Inoculação celular: Para melhorar a eficiência da transfecção, recomenda-se inocular as células um dia antes da transfecção, e a densidade celular no momento da transfecção é preferencialmente de 70% a 80%.

2. Prepare o complexo DNA-PEI: Prepare o complexo reagente de transfecção de ácido nucleico DNA-PEI de acordo com o seguinte sistema:

1) Para cada poço de células, dilua 2 μg de DNA alvo com 100 μL de meio sem soro e misture bem para formar uma diluição de DNA.

[Nota]: Opti-MEM ou ddH2O é recomendado para diluente sem soro

2) Adicione imediatamente 5 μL de reagente de transfecção PEI 25000 a 100 μL de diluente de DNA, agite por 10 segundos e misture bem.

3) Incube em temperatura ambiente por 10-25 min para formar o complexo reagente de transfecção de ácido nucleico catiônico DNA-PEI.

3. Células transfectadas:

1) Durante a formação do complexo, remova o meio de crescimento celular e adicione 2 mL de meio completo fresco e pré-aquecido a cada poço.

2) Adicione 100 μL do complexo DNA-PEI-ácido nucleico-PEI diretamente às células, agite a placa de cultura e misture suavemente.

3) Cultive em uma incubadora de 37°C, 5% de CO2, e a expressão do transgene pode ser detectada em até 7 horas após a transfecção. Por favor, determine você mesmo o tempo de teste adequado.

4. Triagem de rotação constante (opcional)

24 h após a transfecção, as células foram subcultivadas em meio de crescimento fresco (diluir as células mais de 10 vezes) e incubadas durante a noite a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2. No dia seguinte, um medicamento de triagem correspondente ao gene de resistência à transfecção foi adicionado. Clones resistentes a medicamentos podem ser rastreados em cerca de 1 a 2 semanas. Durante esse período, o meio de crescimento contendo os medicamentos de triagem precisa ser substituído com frequência.

Dosagem de transfecção para diferentes recipientes de cultura de células (apenas para referência):