Vero O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras é usado para a análise quantitativa de resíduos de DNA de células hospedeiras Vero em amostras intermediárias, produtos semiacabados e acabados de vários produtos biológicos.

Este kit adota a sonda fluorescente Taqman e o método de reação em cadeia da polimerase (PCR), que tem limite mínimo de detecção de nível fg e pode detectar específica e rapidamente o DNA residual da célula Vero. O kit precisa ser usado junto com o Kit de Preparação de Amostra de DNA Residual (Cat# 18461ES).

Produto Componentes

^*CI: Controle interno

Envio e armazenamento

1. Enviado em gelo seco e armazenado a -20°C para 2 ano

2. Após receber a mercadoria, verifique e armazene-a imediatamente na temperatura de armazenamento correspondente.

Cuidados

1. Leia este manual cuidadosamente antes de usar este reagente. O experimento deve ser padronizado, incluindo o manuseio da amostra, a preparação do sistema de reação e a adição da amostra.

2. A adição de amostras e a preparação de soluções devem ser feitas melhor no gelo.

3. Certifique-se de que cada componente esteja totalmente agitado no vórtice e centrifugado em baixa velocidade antes do uso.

4. Para sua segurança e saúde, use jalecos e luvas descartáveis ​​durante a operação.

5. Este produto é SOMENTE para uso em pesquisa!

Modelos de instrumentos aplicáveis

Inclui, mas não se limita a:

Bio-Rad: Módulo óptico CFX96.

Termo Científico: ITB 7500; Estúdio ABI Quant 5; Etapa ABI OnePlus.

Usando instruções

1. Vero Diluição padrão de DNA e preparação da curva padrão

O Vero O controle de DNA foi diluído em gradiente usando o tampão de diluição de DNA fornecido no kit, e a concentração de diluição é 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Veja instruções detalhadas abaixo:

1.1 Descongele o Vero Controle de DNA e tampão de diluição de DNA em gelo. Após descongelar completamente, agite suavemente no vórtice para misturar e centrifugue em velocidade baixa por 10 segundos.

1.2 Retire seis tubos limpos de 1,5 mL, marcados com 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Adicione 90 μL de tampão de diluição de DNA e 10 μL de Vero Controle de DNA para o 1.Tubo de microcentrífuga de 5 mL rotulado 3 ng/μL e diluir para 3 ng/μL. Misture e centrifugue por 10 segundos. Embale o padrão de DNA diluído e ele pode ser armazenado em curto prazo (não mais que 3 meses) a -80°C. Evite congelamento e descongelamento repetidos.

1.4 Adicione 90 μL de tampão de diluição de DNA em outro tubos e siga o procedimento abaixo para as diluições em série.

[Notas]:

1. São necessários três poços replicados para cada concentração. O intervalo de detecção é de 3 fg/μL-300pg/μL e esse intervalo pode ser expandido se necessário.

2. Para reduzir o número de congelamentos e descongelamentos repetidos e evitar contaminação, é recomendado armazenar o controle de DNA em alíquotas a -80°C pela primeira vez.

3. Uma vez descongelado, o tampão de diluição de DNA pode ser armazenado a 2-8°C por 7 dias, se não for usado por um longo período, armazene a -20°C.

4. Certifique-se de que o molde esteja completamente misturado, agite suavemente a mistura por 15 segundos a 1 minuto para cada diluição de gradiente.

2. Preparação do Controle de Extração e Recuperação (ERC)

Defina a concentração de Vero ADN em ERC conforme necessário (a amostra ERC foi preparado com 3 pg/μL de DNA como exemplo), como segue:

2.1 Adicione 100 μL de amostra de teste em um tubo limpo de 1,5 mL e, em seguida, adicione 10 μL de 3pg/μL Vero Padrão de DNA (③) e misture bem, marcado como ERC.

2.2 Realizar a extração de DNA da amostra ERC juntamente com as amostras de teste para preparar o ERC purificado amostra.

3. Preparação de amostra de controle positivo (PCS) (opcional)

Defina a concentração de Vero DNA em PCS conforme necessário (o PCS foi preparado com 3 pg/μL de DNA como exemplo), como segue:

3.1 Adicionar 100 μL 3 pg/μL Vero Padrão de DNA (③) em um tubo limpo de 1,5 mL, então marcado como PCS.

3.2 Realizar a extração de DNA do PCS juntamente com as amostras de teste para preparar o PCS purificado.

4. Negativo Preparação da solução de controle (NCS)

Defina o controle negativo no experimento, as etapas específicas da operação são as seguintes:

4.1 Adicionar 100 μL matriz de amostra (ou tampão de diluição de DNA) em um tubo limpo de 1,5 mL e então marcado como NCS.

4.2 Realizar a extração de DNA da amostra de NCS juntamente com as amostras de teste para preparar a amostra de NCS purificada.

5. Preparação de Controle de Nenhum Modelo (NTC)

Defina o modelo sem controle no experimento, as etapas específicas da operação são as seguintes:

5.1 O NTC não requer pré-tratamento de amostra e pode ser configurado no estágio de detecção de qPCR do conteúdo residual de DNA.

5.2 A amostra de NTC em cada tubo ou poço é 20 μL Misture (ou seja, 16 μL Mistura Vero qPCR + 4 μL Vero Primer&mistura de sonda) + 20 μL Tampão de diluição de DNA. É recomendado configurar três poços replicados.

6. Sistema de reação de PCR

[Notas]:

1. Calcule o volume total da reação de PCR pelo número de reações: qPCR Mix =(o número de reações+2) × (16+4) μL (incluindo as perdas de dois poços de reação). Mais de três réplicas para cada amostra são recomendadas no experimento.

2. Após tampar o tubo ou selar a placa, centrifugue o tubo ou placa de reação em baixa velocidade por 10 segundos. Após agitar e misturar o suficiente por 5 segundos, repita a centrifugação para coletar o líquido da tampa ou parede para o fundo. Evite bolhas durante a operação.

Veja a tabela abaixo para a configuração de placa recomendada:

O layout da placa inclui: 1 NTC (não modelo controle), 1 NCS (controle negativo solução), 6 DST (curva padrão de 6 concentrações padrão), 3 TS (amostras de teste), 3 ERC (controle de extração e recuperação), 1 PCS (amostra de controle positivo).Três poços replicados para cada amostra.

7. Diretrizes de configuração para um instrumento de PCR (método de 2 etapas)

As instruções a seguir se aplicam somente ao instrumento qPCR Thermo ABI 7500 (Versão do software 2.0). Se você usar um instrumento diferente, consulte o guia do instrumento aplicável para obter diretrizes de configuração.

7.1 Gere um novo experimento, escolha o modelo de quantificação absoluta ou definido pelo usuário.

7.2 Na interface 'Definir' e no painel 'Alvos', adicione um alvo nomeado como FAM, escolha o repórter como 'FAM' e o supressor como 'nenhum'.

7.3 No painel 'Samples', adicione todas as informações das amostras por vez. Em seguida, selecione os poços, escolha o alvo e as amostras correspondentemente. Defina a tarefa do Vero Padrão de DNA como padrão e atribuir os valores 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (a unidade de concentração de DNA em cada poço é fg/μL) na coluna Quantidade e nomeie os poços como STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, correspondentemente. Defina a tarefa do NTC como NTC. Defina o NCS, TS, ERC e PCS como Desconhecido, e nomeou-os de acordo com o layout da Placa acima correspondentemente. Então clique em próximo.

7.4 Defina o programa de amplificação: defina o volume de reação como 40 μL.

8. Análise dos resultados de qPCR

8.1 O sistema fornecerá automaticamente o Threshold no painel Amplification Plot da Analysis. O Threshold fornecido pelo sistema às vezes fica muito próximo da linha de base, resultando em uma grande diferença no Ct entre poços replicados. Você pode ajustar manualmente o Threshold para uma posição apropriada e clicar em Analyze. Então, você pode verificar inicialmente se a curva de amplificação está normal no Multicomponent Plot.

8.2 Na aba Análise de Resultados, revise o gráfico da Curva Padrão. Verifique os valores para a Inclinação, interceptação Y, R2 e Eficiência. Para uma curva padrão normal, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 No 'Tabela de visualização de poços' painel em Análise, as concentrações de cada amostra são mostradas em Quantidade, a unidade é fg/μL, as unidades podem ser convertidas para pg/μL ou pg/mL no relatório do ensaio.

Manuais