O Reactive Oxygen Species Assay Kit usa o reagente permeante celular 2',7'–diclorofluorescina diacetato (DCFDA) para avaliar quantitativamente espécies reativas de oxigênio em amostras de células vivas. O DCFDA lipofílico não fluorescente atravessa prontamente a membrana celular por difusão passiva seguida de desacetilação. O produto desacilado é um oxidante sensível 2',7'-diclorofluoresceína (DCHF). O DCHF é oxidado posteriormente por ROS para formar DCF. O DCF é altamente fluorescente e é detectado por espectroscopia de fluorescência ou citometria de fluxo com excitação/emissão a 480 nm/525 nm. Rosup, uma mistura de compostos, é um indutor de ROS e pode ser usado como um controle positivo.

Componentes do produto

Envio e armazenamento

Este kit é enviado com uma bolsa de gelo. Armazene a -20°C sem luz por 1 ano. Evite congelamento e descongelamento repetidos.

Método de aplicação

1. Preparação de reagentes
Solução DCFH-DA: Centrifugue brevemente em baixa velocidade antes de abrir. Prepare uma solução DCFH-DA de trabalho diluindo 10 mM de DCFH-DA em meio sem soro para fazer uma concentração final de 10 μM.
[Nota]: DCFH-DA também pode ser diluído em meio sem vermelho de fenol. Use solução DCFH-DA recém-preparada, o armazenamento de longo prazo de DCFH-DA diluído não é recomendado. A concentração exata de DCFH-DA necessária dependerá da linhagem celular sendo usada, mas uma faixa inicial geral seria de 10 a 50 μM. Para certas células, se a fluorescência do controle negativo (sem sonda DCFH-DA) for muito forte, dilua DCFH-DA para 2 a 5 μM e encurte o tempo de incubação apropriadamente.
Solução Rosup: Prepare uma solução de trabalho Rosup de 100 µM diluindo 100 mM de solução estoque Rosup em meio sem soro. Geralmente, a incubação com Rosup a 37 ℃ por 30 min-4 h no escuro pode aumentar significativamente o ROS.
[Nota]: O tempo de incubação de Rosup dependerá da sensibilidade da linhagem celular. Por exemplo, 30 min para Hela e 1,5 h para MRC5. Se o aumento de ROS não for observado em 30 minutos, o tempo de indução ou a concentração podem ser adequadamente aumentados. Se ROS aumentar muito rápido, o tempo de indução ou a concentração podem ser adequadamente reduzidos.
Medicamentos: Prepare o medicamento de interesse em meio completo com 10% de SFB ou outra solução apropriada na concentração desejada.
2. Protocolo recomendado para células aderentes
a) Preparação das células: Cultive células aderentes em meio de cultura celular padrão no dia anterior ao experimento para que a confluência celular atinja 70% no momento do experimento.
b) Indução de fármacos: Remova o meio. Sobreponha cada poço com fármacos diluídos sem soro previamente preparados e incube pelo tempo desejado a 37°C no escuro.
c) (Opcional) Controle positivo: Sobrepor o poço de controle positivo com solução de Rosup previamente preparada e incubar pelo tempo desejado a 37°C no escuro.
[Nota]: Para células com tempo de estimulação curto (geralmente dentro de 2 horas), a sonda também pode ser carregada primeiro e, em seguida, adicionar Rosup ou um medicamento de interesse.
d) Carregamento da sonda ROS: Remova todo o meio e lave as células com meio sem soro por 1-2 vezes. Sobreponha cada poço com a Solução DCFH-DA previamente preparada. Incube a 37℃ por 30 min no escuro.
e) Remova o meio e lave as células 1-2 vezes com meio sem soro para remover DCFH-DA livre.
3. Protocolo recomendado para células em suspensão
a) Preparação das células: Cultive as células em suspensão até aproximadamente 1,5 × 105 células por poço no dia do experimento.
b) Indução de fármacos: coletar as células em um tubo cônico por centrifugação e ressuspensá-las em uma quantidade apropriada de fármacos diluídos sem soro previamente preparados e incubar pelo tempo desejado a 37°C no escuro.
c) (Opcional) Controle positivo: Ressuspender as células de controle positivo com solução de Rosup previamente preparada e incubar pelo tempo desejado a 37°C no escuro.
d) Carregamento da sonda ROS: Coletar em um novo tubo e lavar as células por centrifugação duas vezes em PBS. Ressuspender as células com a solução DCFH-DA previamente preparada com densidade celular de 1×106-2×107/mL. Em seguida, incubar a 37℃ por 30 min no escuro. Inverter o tubo a cada 3-5 minutos para garantir contato total entre a sonda e as células.
[Nota]: A densidade celular deve ser ajustada de acordo com o método de detecção subsequente. Por exemplo, para citometria de fluxo, o número de células em um único tubo não deve ser menor que 104/mL ou maior que 106/mL.
e) Coletar e lavar as células por centrifugação duas vezes com meio sem soro para remover DCFH-DA livre.
4. Detecção de fluorescência e análise de dados
Medição de microscopia fluorescente: Realize microscopia de células vivas com um conjunto de filtros apropriado para fluoresceína (FITC) usando um microscópio de fluorescência. Classifique visualmente as células para brilho e compare entre controle e amostras ou use métodos de análise de imagem para comparar sinais entre fotografias digitais de células.
Medição de Citometria de Fluxo: As células aderentes devem ser coletadas com tripsina para preparar uma única suspensão de células; Para células em suspensão, as células são coletadas diretamente. Idealmente, 10.000 células devem ser analisadas por condição experimental. As células não devem ser excessivamente densas durante o experimento (<1 ×106 células/mL). Exclua detritos e isole a população de células de interesse com gating. Usando a intensidade média de fluorescência, determine a mudança de dobra entre amostras de controle e tratadas com Ex/Em = 480/525 nm.
Medição de microplaca fluorescente: Meça a placa imediatamente em um leitor de placas de fluorescência em Ex/Em = 480/525 nm no modo de ponto final na presença de meio. Subtraia as leituras em branco de todas as medições e determine a alteração de dobra do controle do ensaio.

Cuidados

1. Lave as células após a incubação com DCFH-DA para reduzir o ruído de fundo.
2. Recomenda-se medir a fluorescência o mais rápido possível após a incubação para evitar possíveis erros.
3. Para sua segurança e saúde, use jalecos e luvas descartáveis ​​para a operação.
4. Somente para uso em pesquisa!