Puromicina é um antibiótico aminoglicosídeo produzido pela fermentação e metabolismo de Streptomyces alboniger, que mata bactérias Gram-positivas, várias células animais e de insetos ao inibir a síntese de proteínas. A puromicina é eficaz contra E. coli em alguns casos. O mecanismo é que puromicina é um análogo do terminal 3´ das moléculas de aminoil-TrNA, que pode se ligar ao sítio A do ribossomo e ser incorporado à cadeia peptídica estendida. Após a puromicina se ligar ao sítio A, ela não participará de nenhuma reação subsequente, resultando no término prematuro da síntese de proteínas e na liberação de polipeptídeos imaturos contendo puromicina no C-terminal.

O gene pac encontrado na cepa produtora de puromicina Streptomyces alboniger codifica uma puromicina N-acetiltransferase (PAC) que confere resistência à puromicina. Essa propriedade agora é comumente usada para rastrear linhagens celulares transfetadas de mamíferos de forma estável carregando plasmídeos do gene pac.

A aplicação geral da puromicina na seleção de transfecções celulares estáveis ​​está relacionada às características dos vetores lentivirais. A maioria dos vetores lentivirais comerciais agora carrega o gene pac. Em alguns casos específicos, a puromicina também pode ser usada para rastrear a transformação de cepas de E. coli carregando o plasmídeo do gene pac.

Este produto é adequado para cultura de células, a concentração de trabalho comum é de 1-10 µg/mL.

Além disso, a empresa Yeasen também fornece puromicina (cat# 60209ES) em forma de solução, que está em um estado diferente, mas tem a mesma função.

Características

Pureza≥98%

Aplicações

Adequado para cultura de células

Scepas de células de mamíferos transfectadas de forma estável e específicas de creen portadoras de plasmídeos portadores do gene pac

Tela o estirpes de E. coli transformadas portadoras do plasmídeo do gene pac

Especificações

Componentes

Envio e armazenamento

O puromicina eihidrocloreto os produtos devem ser armazenados a -15℃ ~ -25℃ para 2 anos.

Instruções

1. Concentração de trabalho sugerida

Células de mamíferos: 1-10 µg/mL, a concentração ideal precisa ser determinada pela curva de mortalidade.

Escherichia coli: O meio LB ágar foi usado para rastrear Escherichia coli transformada de forma estável com o gene pac em uma concentração de 125 µg/mL.

Observação: A triagem de cepas estáveis ​​de E. coli usando puromicina requer ajuste preciso do pH.

Concentrações recomendadas de puromicina cloridrato

2. Método de dissolução

Dissolva puromicina em água destilada para preparar uma solução estoque de 50 mg/mL. Após esterilização por filtração através de um 0,22 µmembrana de filtro m, aliquotar e armazenar a -25 a -15°C. Alternativamente, ele pode ser dissolvido em metanol para preparar uma solução de armazenamento de 10 mg/mL.

3. Determinação de puromicina curva de morte (tomando como exemplo a transfecção de shRNA ou a transdução de lentivírus)

A concentração efetiva de triagem de puromicina está relacionado ao tipo de célula, estado de crescimento, densidade celular, metabolismo celular e posição do ciclo celular. Para rastrear linhas celulares shRNA de expressão estável, é essencial determinar a concentração mínima de puromicina que mata células não transfectadas/transduzidas. É recomendado que os clientes que estão fazendo experimentos pela primeira vez estabeleçam uma curva de morte adequada para seu próprio sistema experimental.

1) Dia 1: A placa de 24 poços é semeada com uma densidade de 5-8×104 células/poço, e um número suficiente de poços são plaqueados para experimentos de gradiente subsequentes. As células foram incubadas durante a noite a 37°C.

2) Dia 2: A) Preparar meio de triagem: meio fresco contendo diferentes concentrações de puromicina (como 0-15 µg/mL, pelo menos 5 gradientes); B) Substituir o meio de triagem recém-preparado nas células após a incubação durante a noite; Em seguida, as células são incubadas a 37°C.

3) Dia 4: Substituir por meio de seleção fresco e observar a viabilidade celular.

4) Dependendo do estado de crescimento das células, troque para meio de seleção fresco a cada 2-3 dias.

5) As células foram monitoradas diariamente para observar a taxa de células viáveis ​​para determinar a menor concentração de medicamento eficaz para matar células não transfectadas ou todas as células não transduzidas dentro de 4 a 6 dias do início da triagem com antibióticos.

4. Triagem de linhas celulares transfectadas de forma estável em mamíferos

Após a transfecção do plasmídeo contendo o gene pac, as células foram propagadas em um meio contendo puromicina para selecionar transfectantes estáveis.

1) 48 h após a transfecção, as células (originais ou diluídas) são cultivadas em meio fresco contendo concentração apropriada de puromicina.

Nota: Os antibióticos são mais eficazes quando as células estão se dividindo ativamente. Se as células forem muito densas, a eficácia dos antibióticos será significativamente reduzida. É melhor plaquear as células em uma densidade de no máximo 25%.

2) Remover e recolocar o meio de cultura contendo puromicina a cada 2-3 dias.

3) Focos formados por células são avaliados 7 dias após a triagem. Lesões podem exigir uma semana adicional ou mais, dependendo da linhagem celular hospedeira e da eficiência da triagem de transfecção.

Nota: Observe o status de crescimento celular todos os dias. A triagem de puromicina requer pelo menos 48 h, e o período de triagem da concentração efetiva de puromicina é geralmente de 3 a 10 dias.

4) Transfira e coloque 5-10 clones resistentes em uma placa de Petri de 35 mm e continue a cultivar com meio de seleção por 7 dias. Esta cultura de enriquecimento é para preparar para o futuro experimento de citotoxicidade.

Documentos:

Ficha de dados de segurança

60210_MSDS_HB220421_EN.pdf

Manuais

60210_Manual_HB250114_EN.pdf

Citações e referências:

[1] Furge KA. et al., 2001. Supressão da tumorigenicidade e metástase mediadas por Ras através da inibição da tirosina quinase do receptor Met. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014. Rab5 é necessário em células cancerosas metastáticas para ativação, migração e invasão de Rac1 aumentadas por Caveolina-1. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Controle da hipertensão baseado em recompensa por uma interface cérebro-dopamina sintética. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. BID proapoptótico é um efetor ATM na resposta a danos no DNA da célula. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) induz uma eliminação acelerada dependente de CCR5 de sindecan-1 (CD138) e sindecan-4 de células HeLa e formas.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, et al. A proteína da hemocromatose hereditária, HFE, inibe a captação de ferro por meio da regulação negativa de Zip14 em células HepG2[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. O complexo TSC1-TSC2 é necessário para a ativação adequada de mTOR2[J]. Molecular and Cellular Biology, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KRegulação negativa de micro-RNA-1 (miR-1) em câncer de pulmão. Supressão da propriedade tumorigênica de células de câncer de pulmão e sua sensibilização à apoptose induzida por doxorrubicina por miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, et al. Integração do bacteriófago Mu em genomas de leveduras e mamíferos [J]. Pesquisa de Ácidos Nucleicos, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, et al. Uma via cGAS-STING-PERK não canônica facilita o programa de tradução crítico para a senescência e fibrose de órgãos. Nat Cell Biol. 2022 maio;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 maio 2. PMID: 35501370.

[11] Lu T, et al. CD73 em pequenas vesículas extracelulares derivadas de HNSCC define imunossupressão associada a tumor mediada por macrófagos no microambiente. J Extracell Vesicles. 2022 maio;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, et al.Identificação da protease 32 específica da ubiquitina como um oncogene no glioblastoma e os mecanismos subjacentes. Sci Rep. 2022 Abr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, et al. A proteína 1 associada à globulina do útero (UGRP1) se liga à podoplanina (PDPN) para promover uma nova via de inflamação durante a infecção por Streptococcus pneumoniae. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, et al. O eixo MORTALIN-Ca2+ impulsiona a resistência inata ao rituximabe no linfoma difuso de grandes células B. Cancer Lett. 2022 Jul 1; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 Abr 18. PMID: 35447282.