G418 Sulfato, também conhecido como Geneticina Sulfato, é um antibiótico aminoglicosídeo e estruturalmente similar à Gentamicina B1. Ele interfere na síntese de proteínas ao se ligar ao ribossomo 80s e bloquear as etapas de alongamento. G418 Sulfato é tóxico para células procarióticas e eucarióticas, incluindo bactérias, leveduras, células vegetais superiores e de mamíferos, bem como protozoários e vermes. O gene de resistência (principalmente neo), localizado no transposon Tn601 (903) ou Tn5, é derivado de bactérias, mas pode ser expresso em células eucarióticas. O gene de resistência pode ser introduzido em células por meio de técnicas de recombinação de genes para obter resistência de G418, que pode ser usado para rastrear e manter a cultura de células procarióticas ou eucarióticas portadoras do gene de resistência.

Em células de mamíferos, neo, codifica a expressão da amino-glicosídeo 3' -fosfotransferase (APH (3') II) após ser integrada ao genoma eucariótico. Esta enzima inativa o antibiótico modificando covalentemente a função amino ou hidroxila de G418 e inibindo a interação antibiótico-ribossomo, dotando a célula de resistência a G418. Em experimentos de triagem de linhagem celular estável, as curvas de morte (curvas dose-resposta) devem ser estabelecidas para determinar a concentração mínima efetiva para matar células não resistentes.

Em células vegetais, a resistência pode ser obtida pela transfecção do plasmídeo resistente ao gene nptII. O gene nptII também codifica a aminoglicosídeo fosfotransferase, uma enzima que inativa vários antibióticos, incluindo G418, canamicina e palomicina.

Características

Pureza≥98%

Produção padronizada, usando o modo de produção em massa da fábrica

Ampla gama de aplicações, podendo ser utilizadas nas áreas de biologia molecular e pesquisa experimental bioquímica de cultura de tecidos

A plataforma de cooperação abrange toda a

Para garantir a estabilidade da qualidade do produto, a diferença entre os lotes é controlada em 1%.

Aplicações

Triagem de linhas celulares transfetadas de forma estável

Especificações

Componentes

Envio e armazenamento

O Sulfato G418 (Geneticina) os produtos devem ser armazenados a -15℃ ~ -25℃ para 3 anos.

Instruções

1. Preparação da solução de armazenamento G418 (50 mg/mL, concentração ativa)

1) Conversão de unidades de atividade

A conversão foi realizada de acordo com esta fórmula: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Valor de potência do G418, que varia de lote para lote. Veja o relatório de qualidade do lote ou o rótulo no frasco.

A1: A concentração de G418 ativo que você deseja.

A2: A concentração real de G418.

Por exemplo, se o valor da atividade G418 do lote for 750 U/mg e a concentração ativa de G418 for 50 mg/mL, a concentração real do pó a ser preparado é 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/mL. Se 10 mL da solução de armazenamento G418 (concentração ativa, 50 mg/mL) forem preparados, 666,7 mg de pó devem ser pesados.

2) Esterilização e preservação

Pese o pó obtido pela conversão acima e adicione 10 mL de água deionizada estéril para dissolvê-lo completamente.

Pré-molhe o filtro de agulha de 0,22 μm com 5 mL de água deionizada estéril e, em seguida, esterilize a solução G418 por filtração.Aliquote a solução G418 esterilizada e armazene a -20℃.

Observação: ① Não filtre a solução turva, pois como a solução não está completamente dissolvida, o processo de filtração causará perda do fármaco, reduzindo a atividade da solução final. ② Não é recomendado usar meios de cultura, soluções de fosfato ou solventes orgânicos para preparar a solução de armazenamento.

2. Concentração de triagem comumente usada

Em geral, uma alta concentração de G418 é necessária inicialmente para triagem de transforters e use uma concentração baixa para manter a cultura. Condições de crescimento, tipos de células e outros fatores ambientais podem afetar a dosagem efetiva de G418, então é recomendado determinar a concentração ótima de triagem através da curva de morte (curva dose-resposta).

Geralmente, a faixa de triagem de células de mamíferos é de 200-2000 μg/mL, células vegetais: 10-100 μg/mL, células de levedura: 500-1000 μg/mL.

Dados experimentais de linhagem celular

3. Estabelecimento da curva de mortalidade

Nota: Para rastrear linhas celulares com expressão estável de proteínas alvo, é necessário determinar a concentração mínima de antibióticos que podem matar células hospedeiras não transfectadas. Isso pode ser alcançado estabelecendo uma curva de morte (curva dose-resposta). Pelo menos seis concentrações devem ser selecionadas. G418 é mais ativo ao tratar células mitóticas, então as células precisam ser cultivadas por um período de tempo antes de adicionar G418.

1) Dia 1: As células não transformadas são colocadas em uma placa de cultura apropriada com uma densidade celular de 20-25% a 37℃ e cultivadas durante a noite em CO₂;

Nota: Para células que requerem maior densidade para detectar viabilidade, a quantidade de inoculação pode ser aumentada.

2) Defina o gradiente de concentração G418 dentro da faixa apropriada de acordo com o tipo de célula. Células de mamíferos podem ser definidas em 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Dia 2: Remova o meio antigo e substitua-o por um meio recém-preparado contendo a concentração correspondente de drogas. Faça três paralelos para cada concentração.

4) Em seguida, substitua por meio novo contendo G418 a cada 3-4 dias.

5) Contagens de células vivas são realizadas em um ciclo fixo (por exemplo, a cada 2 dias) para determinar a concentração apropriada. Escolha a concentração mínima, que mata a maioria das células dentro de um número ideal de dias (geralmente 7-10 dias), como a concentração de trabalho para triagem de células de transfecção estáveis.

4. Triagem de células transfectadas estáveis

1) 48 h após a transfecção, o meio de cultura G418 contendo concentração apropriada foi utilizado para subcultura (subcultura direta ou subcultura diluída).

Observação: para obter bons resultados de triagem, é recomendável diluir as células em até 25% de abundância.

2) Troque o meio de triagem contendo os medicamentos a cada 3-4 dias.

3) Meça a formação de colônias de células após 7 dias de triagem. A formação de colônias pode levar outra semana ou mais, dependendo do tipo de célula hospedeira, transfecção e eficácia da triagem.

4) 5-10 clones resistentes foram selecionados e transferidos para placas de cultura de células de 35 mm e cultivados com meio de triagem contendo o fármaco por 7 dias.

5) Substitua pelo meio normal.

Documentos:

Ficha de dados de segurança

60220_MSDS_HB220421_EN.pdf

Manuais

60220_Manual_HB250115_EN.pdf

Figuras

Figura 1.Teste de estabilidade e validação da concentração efetiva de genomicina entre diferentes lotes

Cepa experimental: E. coli

G69 e G99 são dois lotes diferentes

A concentração de uso de genomicina foi determinada como sendo 8 mg/L, 12 mg/L e 16 mg/L, respectivamente, e a concentração mínima efetiva foi determinada como sendo 16 mg/L, o que inibiu perfeitamente o crescimento de bactérias diversas. O desempenho dos dois lotes foi consistente.