Descrição
A higromicina B, um antibiótico aminoglicosídeo sintetizado pelo Streptomyces hygroscopicus, inibe a síntese de proteínas ao interferir na translocação ribossômica 70S e induzir a leitura incorreta do molde de mRNA, matando assim procariontes (como bactérias), eucariotos (como leveduras, fungos) e eucariotos de mamíferos superiores.
Os genes de resistência à higromicina (hyg ou hph) derivados de Escherichia coli codificam a higromicina B fosfotransferase, que desintoxica a higromicina B em um produto fosforilado não biologicamente ativo, tornando-a um excelente marcador seletivo para triagem e cultivo de células procarióticas ou eucarióticas transfetadas com sucesso com genes de resistência à higromicina. Além disso, devido aos diferentes modos de ação, a higromicina B é frequentemente usada em combinação com G418 ou Blasticidina S para a seleção de linhagens celulares duplamente resistentes. A higromicina B também pode ser usada como um agente antiviral porque penetra seletivamente em células com maior permeabilidade da membrana devido à infecção viral e inibe a tradução. Ela também pode atuar como repelente de insetos por meio de mistura com ração animal.
Este produto é uma solução estéril de higromicina B (50 mg/mL em tampão PBS) e pode ser diluída diretamente para uso com um meio de cultura.
Características
Produção padronizada, usando o modo de produção em massa da fábrica
Aplicações
Estéril
Triagem de linhas celulares transfetadas de forma estável
Especificações
| Nº CAS. | 31282-04-9 |
| Fórmula Molecular | C20E37Não3O13 |
| Peso molecular | 527,52 g/mol |
| Pureza | >90% (CLAE) |
| Potência | ≥1000 U/mg |
| Estrutura |
|
Componentes
| Componentes No. | Nome | 60224ES03 | 60224ES10 |
| 60224 | Higromicina B (50 mg/mL) | 1 g (20 mL) | 10 X 1 g (20 mL) |
Envio e armazenamento
O Higromicina B (50 mg/mL) os produtos devem ser armazenados em 2°C ~ 8°C para 2 anos.
Instruções
1. Concentração de triagem comumente usada
A concentração de trabalho de higromicina B usada para rastrear cepas de transferência estáveis precisa variar dependendo do tipo de célula, meio, condições de crescimento e taxa metabólica celular, com concentrações recomendadas de 50-1000 µg/mL. Para o primeiro sistema experimental, uma curva de morte (kill curve), a curva de reatividade da dose, é recomendada para determinar a concentração de triagem ideal.
Em geral, células de mamíferos: 50-500 µg/mL; Células bacterianas/vegetais: 20-200 µg/mL; Fungos: 300-1000 µg/mL.
2. Estabelecimento da curva de mortalidade
Nota: Para rastrear linhas celulares estáveis, é necessário determinar a concentração mínima de antibióticos capazes de matar células hospedeiras não transfectadas. Isso pode ser alcançado estabelecendo uma curva de morte (curva dose-resposta). Pelo menos cinco concentrações devem ser organizadas.
1) Dia 1: As células não transformadas são colocadas em uma placa de cultura apropriada com uma densidade celular de 20-25% e cultivadas durante a noite.
Observação: a quantidade de células de inoculação pode ser aumentada para células que exigem maior densidade para detectar vitalidade.
2) Defina o gradiente de concentração dentro do intervalo apropriado de acordo com o tipo de célula. A célula de mamífero pode definir 50, 100, 250, 500, 750, 1000 µg/mL. Dilua a solução de Higromicina B 1:10 com água deionizada ou tampão PBS para 5 mg/mL. E então dilua a solução para a concentração de trabalho correspondente de acordo com a tabela a seguir.
| Concentração Final (µg/mL) | Volume médio (mL) | Volume de adição de 5 mg/mL de Higromicina B (mL) |
| 50 | 9.9 | 0,1 |
| 100 | 9.8 | 0,2 |
| 250 | 9,5 | 0,5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8,5 | 1.5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) Dia 2: Substituir por um meio recém-preparado contendo a concentração correspondente do fármaco. Faça três amostras paralelas para cada concentração.
4) Em seguida, substitua por meio novo contendo medicamentos a cada 3-4 dias.
5) Conduza contagens de células vivas em intervalos fixos (como a cada 2 dias) para determinar a concentração apropriada que inibe o crescimento de células não transfectadas. Selecione a menor concentração que pode matar a vasta maioria das células dentro do número ideal de dias (geralmente 7-10 dias) como a concentração de trabalho para seleção de transfectante estável.
3. Triagem de linhas celulares transfectadas de forma estável em mamíferos
1) 48 h após a transfecção, as células foram subcultivadas em meio de triagem contendo higromicina B na concentração apropriada (direta ou diluída).
Nota: Os antibióticos funcionam melhor em células que se dividem ativamente. Se as células forem muito densas, o antibiótico não as matará. Divida as células de modo que elas não fiquem mais do que 25% confluentes.
2) Troque o meio de triagem a cada 3-4 dias.
3) Meça a formação de colônias de células após 7 dias de triagem. A formação de colônias pode levar outra semana ou mais, dependendo do tipo de célula hospedeira, transfecção e eficácia da triagem.
4) Selecione 5-10 clones resistentes e transfira para placas de cultura de células de 35 mm e cultive com meio de triagem contendo o medicamento por 7 dias.
5) Substituir por meio fresco sem drogas para cultura.
Documentos:
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Investigação
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