Aureobasidin A, também conhecida como AbA, Basifungin, breomicina A, é um antibiótico peptídeo éster cíclico isolado do fungo filamentoso Aureobasidium Pullulans No. R106. Ele tem uma forte capacidade antifúngica e é um inibidor da ceramida sintase fosforilada de inositol AUR1. Ele é tóxico para leveduras mesmo em concentrações mais baixas (0,1-0,5 μg/mL). Espécies de fungos suscetíveis à Aureobasidina A incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans e A. niger. Espécies de fungos suscetíveis a ela incluem levedura dental (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces millet (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) e Aspergillus niger (A. niger.). O mecanismo de ação é que a Aureobasidina A inibe a atividade da inositol fosforamidita (inositol fosforilceramida, IPC) sintase, da qual o crescimento fúngico depende, e interfere na síntese de esfingolipídeos, matando ainda mais a cepa. Mais genes que codificam IPC sintases foram estudados como o gene AUR 1 de Saccharomyces cerevisiae e o gene AURA de A. sinensis, que tem homologia. O silenciamento desses genes codificadores torna as linhagens resistentes à Aureobasidina A, como o gene AUR 1-C.

Aureobasidin A é altamente adequada como um marcador de seleção de fármacos para triagem de clones positivos. A resistência a Aureobasidin A também é um repórter ideal em estudos de híbridos simples e duplos de levedura. Este produto é uma solução de Aureobasidin A dissolvida em metanol com uma concentração de 1 mg/mL.

Características

Pureza≥97%

Produção padronizada, usando o modo de produção em massa da fábrica

Aplicações

Estudos de dois híbridos de levedura

Estudos de levedura híbrida

Marcador rigoroso de seleção de medicamentos de levedura

A resistência à aureobasidina A é um repórter ideal para estudos de hibridização de leveduras

Especificações

Componentes

Envio e armazenamento

O Aureobasidina A（AbA） os produtos devem ser armazenados em -15°C ~ -25°C para 2 anos.

Instruções

1. Concentração de trabalho

Consulte a literatura relevante para obter informações sobre concentração específica e explore e otimize de acordo com suas próprias condições experimentais (como propósito experimental, tipo de célula, características de cultura, etc.).

2. Experimento celular (experimento in vitro)

Aureobasidina A interrompe o crescimento de células de levedura por meio da intoxicação por ceramida e da privação de inositolfosforilceramidas essenciais^[1].

Repetições triplas em tandem de cada motivo CArG-box foram sintetizadas. Todos os fragmentos de DNA foram clonados no vetor Y1H pAbAi (Clontech, Mountain View, EUA) usando sítios de restrição adequados. Então, cada construção pAbAi montada foi linearizada com BstbI e transformada na cepa Saccharomyces cerevisiae Y1HGold de acordo com o Manual do Sistema de Transformação de Levedura 2 (Clontech, Mountain View, EUA). Os clones que carregam o fragmento de DNA desejado foram rastreados para autoativação em meio de eliminação de uracila sintética suplementado com Aureobasidina A na concentração de 100–900 ng/mL, conforme indicado (Clontech, Mountain View, EUA)^[2].

Os quadros de leitura abertos (ORFs) dos genes SlBES1 foram amplificados e ligados ao plasmídeo pGBKT7-GAL4BD. As construções de fusão GAL4BD-SlBES1 foram posteriormente transformadas em células de levedura Y2H Gold. O SD/−Placas de meio Trp foram usadas para cultivar os transformantes de levedura.O umA atividade da -galactosidase dos transformantes foi identificada por X-um-gal e a expressão de AUR1-C foi rastreada por Aureobasidina A^[3].

3. Concentrações inibitórias mínimas de Aureobasidina para várias leveduras

4. Procedimentos operacionais (para sistema de transformação de levedura resistente a AbA)

1) Adicione 0,5 mL de cultura de levedura durante a noite a 50 mL de meio YPD (composição: 1 L de meio líquido contém 10 g de extrato de levedura, 20 g de polipeptona, 20 g de D-glicose; para meio sólido, adicione mais 2% de ágar).

2) Incubar a 30°C por aproximadamente 6 horas, até que a OD660 seja 1-2. Ao usar diploides, meça a OD660 para ser 2-4.

3) Centrifugar a 1.000×g por 5 minutos.

4) Ressuspenda o pellet em 10 mL da Solução A (composição: 100 mM de acetato de lítio, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA) e centrifugue a 1.000×g por 5 minutos.

5) Esuspenda o pellet na Solução A até que a DO660 seja 150.

6) Aliquotar 100 µL da suspensão de células em um tubo e incubar a 30°C por 1 hora.

7) Adicione 5 µg do vetor (DNA circular ou linear) e 150 µg de DNA transportador (que foi aquecido a 100°C por 10 minutos e depois resfriado rapidamente).

Nota: pAUR101 requer DNA linear para transformação. Usar DNA circular reduzirá a eficiência da transformação ou pode até falhar. pAUR112 e pAUR123 requerem DNA plasmídeo completo para transformação.

8) Adicione 850 µL da Solução B (composição: dissolver 40 g de Polietilenoglicol 4000 em 100 mL da Solução A e misturar bem, preparar fresco antes de usar) e misturar delicadamente.

9) Incubar a 30°C por 30 minutos, depois a 42°C por 15 minutos.

10) Deixe em temperatura ambiente por 10 minutos.

11) Centrifugue a 5.000 rpm por 1 minuto e ressuspenda o pellet em 5 mL de meio YPD.

12) Incubar a 30°C por 6 horas ou durante a noite.

13) Centrifugue a 5.000-10.000 rpm e ressuspenda o pellet em 1-10 mL de NaCl a 0,9%.

14) Coloque 100 µL da suspensão de células em placas de meio seletivo YPD (contendo uma certa concentração de AbA, dependendo do tipo de cepa).Incubar a 30°C por 3-4 dias até que a transformação esteja completa.

15) Selecione transformantes positivos e/ou determine a eficiência da transformação (expressa como o número de colônias transformadas por micrograma de DNA plasmídeo).

Documentos:

Ficha de dados de segurança

60231_MSDS_HB220420_EN.pdf

Manuais

60231_Manual_HB250116_EN.pdf

Figuras

Figura 1. Gráfico de crescimento da placa de levedura

Cepa experimental:GS115

Quantidade de uso: 0,05 μg/mL、0,1 μg/mL、0,5 μg/mL、1 μg/mL

Tratamento: 3-5 Dias às 30°C

A linha superior é o produto Yeasen, e a linha inferior é a marca T*.