Хотите контролировать рост опухоли у голых мышей в режиме реального времени? Хотите узнать место колонизации клеток у мышей? Хотите узнать эффект медикаментозного лечения опухолей в естественных условиях? Этого можно добиться, установив на ячейку трекер, что позволит вам в любой момент контролировать местоположение и количество ячеек. Эта технология — технология «обнаружения» визуализации in vivo. Так что же такое технология визуализации in vivo?

1. Что такое технология визуализации in vivo?
2. Характеристики визуализации люциферазы
3. Направление применения люциферазной визуализации
4. Экспериментальный пример обмена
5. Часто задаваемые вопросы
6. Информация о продукте
7. О чтении

1. Что такое технология визуализации in vivo?

Еще в 1999 году доктор Вайсследер из Гарвардского университета в США предложил концепцию молекулярной визуализации, то есть использование методов визуализации для проведения качественных и количественных исследований биологических процессов in vivo на клеточном и молекулярном уровнях. Визуализация in vivo основана на молекулярной визуализации. С помощью этой системы визуализации можно наблюдать биологические процессы, такие как рост и метастазирование опухолей, развитие инфекционных заболеваний и экспрессию определенных генов у живых животных.

In vivo оптическая визуализация живых животных в основном использует две технологии: биолюминесценцию и флуоресценцию. Биолюминесценция — это ген люциферазы для маркировки клеток или ДНК, в то время как технология флуоресценции использует флуоресцентные репортерные гены, такие как зеленый флуоресцентный белок и красный флуоресцентный белок, и флуоресценцию, такую ​​как FITC, Cy5 и Cy7. Элементы и квантовые точки (КТ) для маркировки. Биолюминесценция млекопитающих обычно интегрирует ген люциферазы светлячка (состоящий из 554 нуклеотидов, около 50 кДа), то есть ген люциферазы, в хромосомную ДНК ожидаемой клетки наблюдения для экспрессии люциферазы. Затем культивируют линию клеток, которая может стабильно экспрессировать люциферазу, и когда клетки делятся, дифференцируются и переносятся, люцифераза также будет продолжать стабильно экспрессироваться. Гены, клетки и живые животные могут быть помечены геном люциферазы. Люцифераза — это вид фермента, который может катализировать субстраты для получения биолюминесценции. Люциферазы из разных источников имеют свои характеристики и могут катализировать субстраты для испускания света разных цветов. Среди них люцифераза светлячков имеет высокую чувствительность и широкий линейный диапазон 7~8 порядков величины. Она стала наиболее часто используемым репортерным геном клеток млекопитающих. Репортерная плазмида люциферазы была перенесена в клетки, а ее субстрат люциферин был добавлен для инкубации клеток. В присутствии АТФ, O₂, и ионы магния, люцифераза может окислять субстрат люциферина, чтобы вызвать реакцию видимого света. Реализовать «однократную установку „трекера“, а также отслеживать и обнаруживать в любое время». В дополнение к люциферазе светлячков иногда используется люцифераза рениллы. Субстраты двух различны, субстрат первого - D-люциферин, а субстрат второго - целентеразин. Длины волн света, испускаемого двумя, различны, диапазон длины волны света, испускаемого первым, составляет 540-600 нм, а диапазон длины волны света, испускаемого вторым, составляет 460-540 нм. Свет, испускаемый первым, легче проходит через ткани, в то время как последний метаболизируется быстрее в организме, и его специфичность не так хороша, как у первого. Поэтому не большинство экспериментов in vivo с использованием люциферазы светлячков в качестве репортерного гена.

Рисунок 1.Локализация клеток, меченых люциферазой

Оптический принцип биолюминесценции: свет будет рассеиваться и поглощаться при распространении в тканях млекопитающих, а фотоны будут преломляться при столкновении с клеточной мембраной и цитоплазмой, и разные типы клеток и тканей имеют разные характеристики поглощения фотонов. Гемоглобин является основной причиной поглощения видимого света в организме и может поглощать большую часть сине-зеленой полосы видимого света. Но в красной полосе видимого света более 600 нм поглощение гемоглобина очень мало. Поэтому большое количество света может проходить через ткани и кожу, чтобы быть обнаруженным в красноватой области. С помощью технологии биолюминесцентной визуализации живых животных можно обнаружить по крайней мере несколько сотен подкожных клеток. Однако в зависимости от глубины источника света в мыши минимальное количество клеток, которые можно увидеть, варьируется. Вообще говоря, при каждом увеличении на 1 см интенсивность света ослабевает в 10 раз, и ослабление больше для тканей и органов, богатых кровью, и меньше для тканей и органов, прилегающих к костям. В случае одинаковой глубины обнаруженная интенсивность света имеет значительную линейную зависимость от количества клеток, и обнаруженная интенсивность света может быть количественно определена прибором для отражения количества клеток.

Рисунок 2. Люминесцентный принцип реакции люциферазы и калиевой соли люциферина

В отличие от биолюминесценции, флуоресцентная технология использует для маркировки флуоресцентные репортерные гены или флуоресцентные красители (включая новые материалы для наномаркировки, такие как флуоресцентные квантовые точки). Используя флуоресценцию от репортерных генов, флуоресцентных белков или красителей, можно создать биологический источник света in vivo. Биолюминесценция — это автофлуоресценция у животных без источника возбуждающего света, в то время как флуоресценция требует возбуждения внешним источником возбуждающего света, прежде чем ее можно будет обнаружить системой визуализации. Флуоресцентные метки широко используются, включая животных, клетки, микроорганизмы, антитела, лекарства, наноматериалы и т. д.

2. Характеристики визуализации люциферазы

◎ отсутствие радиации, практически безвредно для организмов.

◎ биолюминесценция без источника возбуждающего света.

◎ высокая чувствительность, можно обнаружить сотни клеток.

◎ хорошая проницаемость, глубина проникновения в ткани составляет 3–4 см.

◎ высокое отношение сигнал/шум, сильный сигнал флуоресценции и хорошая защита от помех.

3. Направление применения люциферазной визуализации

3.1 Рост опухоли

В эксперименте по опухолеобразованию на голых мышах рост опухоли наблюдался в реальном времени без инвазии, и не было необходимости в извлечении опухоли для измерения.

3.2 Препараты для лечения онкологии

Было обнаружено влияние введения на рост опухоли или метастазирование, а субстрат флуоресцеина мог быть выведен в течение 3 часов, не мешая эксперименту с препаратом.

3.3 Локализация клеток

Выявлены локализация и распределение чужеродных клеток в организме животных.

3.4 Регуляция экспрессии генов

Целевой ген или промотор целевого гена был объединен с геном люциферазы для выявления изменений экспрессии гена во время лечения лекарственными средствами или течения заболевания.

3.5 Исследования стволовых клеток

Мониторинг трансплантации, выживаемости и пролиферации стволовых клеток; Отслеживание распределения и миграции стволовых клеток в естественных условиях.

4. Эксперимент пример обмен

Рисунок 3. в естественных условиях Визуализационная детекция терапевтического эффекта CAR-MUC1 Т/CAR-MUC1-IL22 Т-клетки на образование опухоли путем подкожной инъекции клеток HN4 в мыши^[1].

Рисунок 4. После инъекции клеток HUC-MSC в скелетные мышцы мышей локализация клеток была обнаружена с помощью в естественных условиях визуализация (отмечено красной стрелкой)^[2].

Рисунок 5. Способность в естественных условиях визуализация для обнаружения миграции мезенхимальных стволовых клеток (MSC) к местам ожогов. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC/FLuc) были введены внутривенно в модель ожога спины у мышей. Через четыре дня после инъекции сигналы биолюминесценции появились в месте повреждения ожоговой раны, а затем постепенно уменьшились (красная стрелка указывает на место ожога)^[3].

5. Часто задаваемые вопросы

В1: Каковы преимущества технологии биолюминесцентной визуализации по сравнению с традиционной технологией?

По сравнению с традиционной технологией эта технология более чувствительна, чем традиционные методы в исследовании метастазов опухолей, генной терапии, эпидемиологии, отслеживания стволовых клеток, лейкемии и других связанных с этим исследований. Она также может быстро и интуитивно изучать патогенез и скрининг лекарств связанных заболеваний с помощью серии моделей трансгенных животных.

В2: Как пометить стволовые клетки геном люциферазы?

Конститутивно экспрессируемые гены могут быть помечены для создания трансгенных мышей, а стволовые клетки помечены. Гемопоэтические стволовые клетки берутся из костного мозга мыши и трансплантируются в костный мозг другой мыши. Эту технологию можно использовать для отслеживания пролиферации, дифференциации и миграции гемопоэтических стволовых клеток в организме. Другой метод — пометить стволовые клетки лентивирусом.

В3: Как долго можно проводить тестирование после инъекции флуоресцеина и как долго может сохраняться свечение?

Обычно сигнал флуоресценции достигает наиболее сильного стабильного периода после внутрибрюшинной инъекции в течение 10-15 мин и начинает затухать через 20-30 мин. Через 3 ч флуоресцеин элиминируется и свечение полностью исчезает.

В4: Как вводить флуоресцеин мышам? В чем разница между методами инъекций?

Флуоресцеин можно вводить мышам внутрибрюшинно или инъекцией в хвостовую вену. Он может распространяться по всему телу мышей примерно за 1 мин. В большинстве случаев концентрация флуоресцеина составляет 150 мг/кг. Для мышей весом 20 г можно использовать около 3 мг флуоресцеина. При внутрибрюшинной инъекции диффузия медленная, начальное свечение медленное, а время непрерывного свечения длительное. При инъекции флуоресцеина в хвостовую вену он быстро диффундирует и быстро начинает испускать свет, но продолжительность свечения короткая.

6.Информация о продукте

Yeasen — биотехнологическая компания, занимающаяся исследованиями, разработкой, производством и продажей трех основных биологических реагентов: молекул, белков и клеток. Продукция, предоставляемая Yeasen, следующая.

Таблица 1. Информация о продукте

7. О чтении

Новое поколение системы обнаружения гена-репортера люциферазы — проще, чувствительнее, точнее