Дорогие друзья, вы чувствуете себя растерянным, сталкиваясь с различными антителами Loading Control и Epitope Tagging во время иммуноблоттинга белков? Белки кодируются генами домашнего хозяйства в организмах и стабильно экспрессируются во многих тканях. Они используются для проверки того, нормально ли проходят иммунологические эксперименты, и в качестве полуколичественного стандарта обнаружения экспрессии белка. Итак, как правильно выбрать антитела для контроля загрузки? Вы можете обратиться к следующим пунктам.
I. Образец происхождения видов
- Для образцов из тканей или клеток млекопитающих обычно выбирают β-актин, α-тубулин, GAPDH, ламин-B, гистон H3, Na+/K+-АТФазу.
- Для образцов растительного происхождения обычно выбирают растительный актин, Рубиско и т. д.
- Для других образцов с меньшим количеством исследований выберите соответствующий белок в качестве внутреннего эталона, обратившись к соответствующей литературе или базам данных.
Убедитесь, что молекулярная масса целевого белка отличается от молекулярной массы контрольной загрузки. более чем на 5 кДа, чтобы предотвратить помехи во время обнаружения. Например, если целевой белок имеет массу 40 кДа, нецелесообразно выбирать β-актин (42 кДа) в качестве контроля нагрузки. Рассмотрите возможность использования GAPDH (36 кДа) или β-тубулина (55 кДа) в качестве контроля нагрузки.
III. Сайт экспрессии внутреннего референтного белка
Примечание: Избегайте следующих ситуаций при использовании контроль загрузки антител
| Субклеточная локализация | Загрузка контрольного белка | Молекулярная масса (кДа) | Примечания |
| Цитоплазма, целая клетка | β-актин | 42 | Не подходит для ядерных экстрактов. β-актин является компонентом комплексов ремоделирования хроматина; может не подходить для ситуаций, когда имеются значительные возрастные различия между субъектами исследования. |
| α-Тубулин | 55 | Не подходит для ситуаций, когда существуют значительные возрастные различия между субъектами исследования. Экспрессия тубулина изменяется под действием антимикробных и антимитотических препаратов, поэтому он не подходит при добавлении противораковых и противогрибковых препаратов. | |
| β-Тубулин | 55 | ||
| ГАПДХ | 36 | Гипоксия клеток приведет к увеличению экспрессии GAPDH, поэтому она не подходит для исследований, связанных с кислородом. Такие факторы, как диабет, могут привести к увеличению экспрессии GAPDH. | |
| Винкулин | 117 | Может быть использован для белков с большой молекулярной массой. | |
| Митохондрии | Серия COXIV | 15-17 | Эта серия белков в основном сконцентрирована на 15-17 кДа. Если молекулярная масса целевого белка близка, рассмотрите другие антитела контроля нагрузки. |
| HSP60 | 60 |
| |
| Ядро | VDAC1/2 | 31-37 | Эта серия белков в основном сконцентрирована в диапазоне 31–37 кДа. |
| Ламин B1 | 66 | Не подходит для эмбриональных стволовых клеток, не подходит для контроля нагрузки в экспериментах по апоптозу. | |
| ПКНА | 36 | Не подходит для непролиферирующих клеток. | |
| ТВП | 33-43 | Массовая доля ТВР у людей составляет 37–43 кДа, а у мышей и крыс — 33–36 кДа. ТВР не подходит для экспериментов по апоптозу. | |
| ГГ1 | 65-70 |
| |
| Гистон H3 | 17 | Большинство белков имеют молекулярную массу около 17 кДа. Если молекулярная масса целевого белка близка, рассмотрите другие контрольные антитела loadong. | |
| Цельная кровь, сыворотка, плазма | Трансферрин | 77 | На экспрессию влияют некоторые заболевания и методы лечения, например, ретиноевая кислота. |
| Альбумин | 66 | Содержание чрезвычайно высокое, обратите внимание на снижение загрузки образца в экспериментах с ВБ. |
Антитела-маркеры работают лучше при совместном использовании
В экспериментах по изучению взаимодействия белков, таких как pull-down, эпитопные метки могут быть слиты с N- или C-концом целевого белка с помощью молекулярно-биологических методов. Обычно используемые эпитопные метки включают His, HA, Myc и GST. Эти эпитопные метки обычно не влияют на биологическую активность и внутриклеточную локализацию целевого белка. Появление эпитопных меток обеспечило удобство для научных исследований и промышленного производства.
| Эпитопный тег | Последовательность тегов | Молекулярный вес (КДа) |
| Тег HA | YPYDVPDYA | 1.1 |
| Тег Myc | EQKLISEEDL | 1.2 |
| Флаг Тег | ДИКДДДДК | 1 |
| Тег GST | - | 26 |
| Тег GFP | - | 26.9 |
| Тег V5 | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| S-тег | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| Электронная метка | GAPVPYPDPLEP | 1.4 |
Информация о продукте
| Тип | Название продукта | Молекулярный вес (КДа) | Номер продукта |
| Загрузка контрольного антитела | β-актин, мышиные моноклональные антитела | 42 | 30101ES |
| β-актин, кроличьи pAb | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (клон: 1A6), мышиные моноклональные антитела | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, Кроличьи pAb | 36 | 30202ES | |
| α-Тубулин, мышиные моноклональные антитела | 50-55 | 30304ES | |
| β-Тубулин, мышиные моноклональные антитела | 50-55 | 30301ES | |
| β-Тубулин, кроличьи pAb | 50-55 | 30302ES |