1 Принцип действия генетомицина

Генетомицин (Geneticin, G418) — аминогликозидный антибиотик, который ингибирует синтез белка, блокируя удлинение пептидной цепи путем связывания с рибосомами 70S и 80S в прокариотических и эукариотических клетках. Этот механизм токсичен для бактерий, дрожжей, растений и клеток млекопитающих. Когда клетки были успешно трансфицированы и интегрированы с геном устойчивости к неомицину (таким как ген neo), кодируемая геном аминогликозидфосфотрансфераза (APH (3) II) могла ковалентно модифицировать G418, чтобы инактивировать его, тем самым придавая устойчивость клеткам, выращенным в селективной среде, содержащей G418.

В молекулярно-генетических тестах G418 является одним из наиболее часто используемых для стабильной трансфекции.

2 Применение геномицина

2.1 Скрининг стабильных трансфицированных клеточных линий

• G418 использовался для скрининга клеток, содержащих гены устойчивости (например, гены neo) путем ингибирования синтеза белка. Аминогликозидфосфотрансфераза, кодируемая геном устойчивости, инактивирует G418, что придает клеткам устойчивость к G418. Обычно диапазон скрининга клеток млекопитающих составляет 200–2000 мкг/мл, при этом наиболее часто используемая рабочая концентрация составляет 100–700 мкг/мл. Если для растительных клеток это 10–100 мкг/мл, а для дрожжевых клеток — 500–1000 мкг/мл, то для некоторых типов клеток с использованием G418 в качестве справочного материала используются следующие концентрации.

Клетка	Приложение	Активационная концентрация геномицина (мкг/мл)	Цитируемые работы
Виды рода Mucor	а) Культивирование в питательной среде б) Культивируется на лиофилизированных бактериях	а) 10 мкг/мл б) 30 мкг/мл	Хирт и др., Труды Национальной академии наук, т. 79, 7356-7360 (1982).
Млекопитающие	а) Для скрининга б) Для поддержания роста	а) 400 -1000 мкг/мл б) 200 мкг/мл	Канаани и Берг, Труды Национальной академии наук, т. 79, 5166-5170 (1982).
Растение	а) Для скрининга б) Для поддержания роста	а) 25-50 мкг/мл б) 10 мкг/мл	Урсик и др., Биохимия, биофизика, научные исследования, т. 101:3, 1031-1037 (1981).
Дрожжи	а) Для скрининга б) Для поддержания роста	а) 500 мкг/мл б) 125-200 мкг/мл	Хименес и Дэвис, Природа, т. 287, 869-871 (1980).
Бактерии	Для скрининга	16 мкг/мл	Вайц и др., Антимикробные агенты Химиотерапевтические, т. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Выключение гена и перенос гена

• При нокауте гена G418 может использоваться для скрининга клеток, которые успешно нокаутируют целевой ген. При переносе гена G418 облегчает интеграцию чужеродных генов в геном клеток-хозяев.

2.3 Отбор устойчивости в культуре клеток

• В процессе культивирования клеток G418 используется для скрининга клеток, устойчивых к антибиотику, которые часто несут специфические гены устойчивости.

3. Соответствующие экспериментальные процедуры для геномицина

3.1 Приготовление исходного раствора G418 (50 мг/мл, активная концентрация)

1) Преобразование единиц деятельности

Конвертируйте по формуле: (1000/A0) × A1 = A2, где A0 — это активность G418, которая варьируется в зависимости от партии. См. отчет о контроле качества для соответствующей партии или этикетку на бутылке. A1 — это желаемая активная концентрация G418, которую необходимо приготовить. A2 — это фактическая концентрация порошка в объеме, которую необходимо взвесить.

Например, если партия G418 имеет активность 750 ЕД/мг, а вы хотите приготовить активную концентрацию 50 мг/мл, то фактическая концентрация порошка, которую необходимо приготовить, составит 1000/750 × 50 мг/мл = 66,67 мг/мл.

При приготовлении 10 мл исходного раствора G418 (активная концентрация 50 мг/мл) потребуется 666,7 мг порошка.

• Стерилизация и хранение

На основании фактического веса порошка, полученного в результате вышеуказанного преобразования, добавьте его к 10 мл стерильной деионизированной воды до полного растворения.

Сначала предварительно смочите шприцевой фильтр 0,22 мкм 5 мл стерильной деионизированной воды, удалив всю воду. Затем отфильтруйте с помощью этого фильтра для стерилизации и аликвотируйте на небольшие объемы для одноразового использования (например, 1 мл) и храните при -20°C в течение 1 года стабильности.

3.2 Установление кривой гибели

1) День первый: поместите нетрансформированные клетки с плотностью клеток 20–25 % в соответствующие культуральные планшеты и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, CO2.₂.

2) Установите градиент концентрации в подходящем диапазоне в зависимости от типа клеток, выбрав не менее 6 концентраций (G418 наиболее активен против клеток в фазе деления, поэтому клетки следует культивировать в течение определенного периода перед добавлением G418), например, для клеток млекопитающих установите 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 мкг/мл.

3) Второй день: Удалите старую питательную среду и замените ее свежеприготовленной средой, содержащей соответствующую концентрацию препарата, с тремя повторениями для каждой концентрации.

4) Заменяйте среду, содержащую лекарственное средство, свежей каждые 3–4 дня.

5) Проводите подсчет живых клеток через фиксированные интервалы (например, каждые 2 дня), чтобы определить соответствующую концентрацию, которая предотвращает рост нетрансфицированных клеток. Выберите самую низкую концентрацию, которая может убить большинство клеток в течение идеального количества дней (обычно 7-10 дней) в качестве рабочей концентрации для скрининга стабильно трансфицированной клеточной линии.

3.3 Скрининг стабильно трансфицированных клеток

• Препарат G418 Geneticin (60220ES), поставляемый компанией Yisheng Biotech, имеет эффективность ≥720 ЕД/мг, чистоту ~98% и стабильность партии, а его цена составляет почти треть от цены продуктов G418 других компаний.
• Среду для скрининга, содержащую препараты, меняли каждые 3–4 дня.
• Образование клеточных клонов (колоний) наблюдалось и оценивалось после 7 дней отбора. Образование колоний может занять неделю или больше, в зависимости от типа клетки-хозяина, трансфекции и эффективности скрининга.
• Отобрали 5–10 устойчивых клонов и перенесли их на 35-миллиметровые планшеты для культивирования клеток, а затем содержали в среде для скрининга, содержащей лекарственные препараты, в течение 7 дней.
• После смены нормальной среды культивирования.

4 Рекомендация по продукту

Генетицин G418 (60220ES) предоставлено Йесеном Эффективность препарата Biotech составляет ≥720 ЕД/мг, чистота — ~98%, стабильность партии — при этом его цена составляет почти треть от цены продукции G418 других компаний.

Спецификация	С*	Т*	Йесен	Преимущество Йесена
Содержание (ВЭЖХ)	/	/	~98%	Высокая чистота
Активность (Ед/мг)	≥720 мкг/мг	707-721 мкг/мг	≥720 мкг/мг	Высокая эффективность
Цена ($/5 г)	~1000	~1000	~200	Дешевизна

5 Экспериментальный случай

В случае E. coli G69 и G99 представляли собой две разные партии; концентрации геномицина составляли 8 мг/л, 12 мг/л и 16 мг/л соответственно, а эффективная минимальная концентрация составляла 16 мг/л, что полностью подавляло рост различных бактерий.