1. Что такое дендритные клетки (ДК)?
Дендритные клетки (ДК) являются наиболее эффективными антигенпрезентирующими клетками (АПК) в организме человека. ДК являются единственными АПК, способными активно стимулировать пролиферацию наивных Т-клеток. Другие типы АПК (такие как моноциты, макрофаги, В-клетки и т. д.) могут стимулировать только активированные или памяти Т-клетки. Таким образом, ДК-клетки являются инициаторами адаптивных иммунных реакций Т-клеток и играют чрезвычайно важную роль в иммунитете опухолей. ДК-клетки в высокой степени экспрессируют молекулы MHC-I и MHC-II на своей поверхности и имеют специфические поверхностные маркеры. Они захватывают, обрабатывают и стимулируют Т-клетки для активации антигенов и в конечном итоге определяют направление дифференциации Т-клеток.
2. Источник постоянного тока
Клетки DC присутствуют в организме в очень малых количествах. Требуется много времени, чтобы напрямую изолировать DC из организма, а выход клеток очень низок, что значительно ограничивает исследования и применение DC. Однако DC можно дифференцировать и индуцировать из клеток-предшественников DC в различных тканях, таких как клетки-предшественники в костномозговой жидкости, моноциты в периферической крови и пуповинной крови.
Для людей, поскольку человеческая периферическая кровь наиболее удобна для получения и имеет наибольшее количество моноцитов, наиболее распространенным методом является индукция ДК из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC). Для мышей наиболее распространенным методом является индукция ДК из клеток костного мозга, а именно дендритных клеток костного мозга (BMDC).
Рисунок 1. Принципиальная схема классического метода приготовления BMDC
3. Метод приготовления BMDC
Распространенными методами подготовки мышиных BMDC являются:
3.1 Классический метод культивирования BMDC - метод Инабы (модифицированный)
3.2 Крупномасштабное приготовление BMDC - метод Sons
3.3 Крупномасштабное приготовление BMDC - метод Лутца
3.1 [Классический метод культивирования BMDC] - Метод Инаба (улучшенный)
【Фон】
а. Количество BMDC, полученных методом Инабы, составляет 5-7 x 106/мышь;
б. В оригинальном методе Инабы для индукции продукции BMDC используется только GM-CSF. Хотя полученные BMDC обладают сильной стимулирующей способностью в смешанной реакции лимфоцитов, зрелость DC не так хороша, как при комбинированной индукции GM-CSF+IL-4. Поэтому в последующем улучшенном методе часто используется комбинированная индукция GM-CSF+IL-4.
【Этапы выращивания】
3.1.1 Получение клеток костного мозга мыши
1) Мышей (возрастом 6–10 недель) умерщвляли путем смещения шейных позвонков, все бедренные и большеберцовые кости удаляли хирургическим путем, а мышечную ткань вокруг костей удаляли, насколько это было возможно, с помощью ножниц и щипцов.
[Примечание] Не повредите кости.
2) Перенесите кость на чистый стол и замочите ее в стерильной чашке для культивирования, содержащей 70% спирта, на 2–5 минут для дезинфекции и стерилизации, затем дважды промойте ее стерильным PBS.
3) Переместите кость в другую новую чашку для культивирования, содержащую PBS, отрежьте два конца кости ножницами, а затем используйте шприц для извлечения PBS. Введите иглу в полость костного мозга с обоих концов кости и несколько раз промойте костный мозг в чашке для культивирования, пока кость не станет полностью белой.
4) Соберите суспензию костного мозга и отфильтруйте мелкие фрагменты и мышечную ткань с помощью нейлоновой сетки с размером ячеек 200 меш.
5) Центрифугируйте фильтрат при 1200 об/мин для 5 мин. и слейте супернатант.
6) Добавьте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов с хлоридом аммония (1x), ресуспендируйте клетки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3-4 часов.5 мин., до 10 мин.
7) Добавьте 10 мл PBS для нейтрализации эффекта лизирующего буфера, затем центрифугируйте при 1200 об/мин в течение 5 мин. и слейте супернатант.
8) Промыть один раз PBS, а затем ресуспендировать клетки в культуральной среде RPMI1640, содержащей 10% FBS. Были получены мышиные клетки костного мозга.
Приготовление раствора лизирующего эритроциты хлорида аммония:
а. Приготовьте 10-кратный раствор для хранения следующим образом: взвесьте 82,9 г NH4Cl, 10,0 г KHCO3 и 0,37 г Na2ЭДТА, растворить в 1 л дистиллированной воды, профильтровать с 0,22 мембранный фильтр мкм для стерилизации и хранения при температуре 4℃ в течение 6 месяцев;
б. Перед применением разбавьте 10-кратный раствор для хранения стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:9 до 1-кратного рабочего раствора.
[Примечание] Поскольку раствор лизиса эритроцитов хлоридом аммония оказывает определенное вредное воздействие на клетки костного мозга, время гемолиза следует максимально сократить.
3.1.2 Индукция дифференцировки BMDC
1) Подсчитайте количество клеток костного мозга мыши, полученных на этапе 1, и доведите концентрацию клеток до 0,5–1×106/мл с полной культуральной средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS.
2) Поместите в 24-луночный культуральный планшет, по 1 мл клеток на лунку, добавьте рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (20 нг/мл) и ИЛ-4 (10 нг/мл), и культивирование при 37℃, 5% CO2 Инкубатор. Это 0-й день культивирования.
【Примечание】
а. Обычно около 4-5x107 Клетки костного мозга можно собрать у одной мыши, поэтому можно засеять не менее 40–50 лунок 24-луночного планшета.
б. Диапазоны концентраций ГМ-КСФ и ИЛ-4 составляют 20-50. нг/мл и 10-40 нг/мл, соответственно.
3) Аккуратно встряхивайте планшет каждые 2 дня, затем заменяйте 3/4 объема свежей питательной средой и восполняйте уровень цитокинов.
4) Между 5-м и 8-м днями осторожно продувайте культуральную среду, чтобы собрать взвешенные клетки и слабо прикрепленные клетки.
5) Центрифуга при 1200 об/мин для 5 мин. и слейте супернатант.
6) Ресуспендируйте клетки в полной культуральной среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, и подсчитайте их, затем доведите концентрацию клеток до 1×106/мл и добавьте рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (20 нг/мл) и ИЛ-4 (10 нг/мл).
7 ) Высевают клетки в 100-миллиметровые культуральные чашки (до 10 мл на чашку) или 6-луночные культуральные чашки (2 мл на лунку).
8) Продолжайте культивировать при температуре 37℃, 5% CO2.2 инкубатор на 1-2 дня.
9) Соберите взвешенные клетки, представляющие собой более зрелые BMDC.
【Примечание】
а. Шаги 2.5–2.8 — это шаги повторного посева, цель которых — сделать BMDC, полученные на шаге 2.4, более зрелыми.
б. В течение 3 часов после повторного посева можно увидеть, как множество шиповатых адгезивных клеток мигрируют из кластеров ДК, а через 1 день культивирования эти адгезивные клетки будут отсоединены от дна культуральной чашки, и можно будет увидеть множество типичных ДК, плавающих в культуральной среде.
3.1.3 Полное созревание BMDC
[Примечание] BMDC, полученные на этапе 2, не являются полностью зрелыми DC. Если вы хотите получить полностью зрелые DC, вам все равно нужно будет индуцировать их LPS, CD40L или TNF-a.
1) Центрифугируйте BMDC, полученный на шаге 2.4 или 2.9, при 1200 об/мин для 5 мин. и слейте супернатант.
2) Ресуспендируйте осадок с помощью полной культуральной среды RPMI, содержащей рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (20 нг/мл) и ИЛ-4 (10 нг/мл) и отрегулируйте концентрацию клеток до 1×106/мл после подсчета.
3) Добавьте в 24-луночные культуральные планшеты и добавьте индукторы созревания, такие как TNF-α (250 Ед/мл), ЛПС (1 мкг/мл) или CD40L (1 мкг/мл).
4) Культивирование при 37℃, 5% CO22 инкубатор на 2 дня.
5) Соберите взвешенные клетки и клетки, которые растут, свободно прикрепленные к стенке, которые представляют собой зрелые дендритные клетки.
3.2【Метод массового производства BMDC】-Метод Сына
【Фон】
а. Этот метод позволяет получить 30-40×106 DC/мышь в течение 7 дней, что в 7-10 раз больше, чем у классического метода Инабы. После центрифугирования DC через 14,5% градиент метризамида чистота (т.е. клетки CD11c+/I-Ab+) может достигать 85-95%.
б. Способность к эндоцитозу ДК, полученных этим методом, слабее, чем у классического метода Инабы, но количество секретируемого IL-12p70 аналогично.
в. ДК, полученные этим методом, обладают более сильной стимулирующей способностью в реакции смешанных лимфоцитов, чем классический метод Инабы.
г. ДК, полученные этим методом, могут вызывать более сильный специфический ответ Т-клеток.
е. Подводя итог, можно сказать, что метод Сона позволяет получать более зрелые BMDC, чем классический метод.
【Этапы выращивания】
3.2.1 Получение клеток костного мозга мыши
См. соответствующие шаги в методе Инабы (измененном).
3.2.2 Приготовление больших количеств BMDC
1) Подсчитайте количество клеток костного мозга мыши, полученных на этапе 1, и доведите концентрацию клеток до 2×105/мл с полной культуральной средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS.
2) Разложить по 6-луночным культуральным планшетам, по 5 мл клеток на лунку, добавить рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (1000 Ед/мл) и ИЛ-4 (1000 Ед/мл), и культивирование при 37℃, 5% CO2 инкубатор.
3) На 4-й день культивирования дополните культуральную систему рекомбинантным мышиным ГМ-КСФ (1000 Ед/мл) и ИЛ-4 (1000 Ед/мл).
4) Соберите ДК на 7-й день культивирования, ресуспендируйте с 2-4 мл полной питательной среды RPMI 1640, добавьте к равному объему 14,5% (мас./об.) мепанемы и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 20 мин при 1200xg.
5) Соберите средний слой и промойте его три раза полной питательной средой RPMI 1640 для дальнейшего использования.
[Примечание] На данном этапе DC представляет собой незрелый BMDC. Если вы хотите сделать его более зрелым, перейдите к шагу 3.
3.2.3 Полная зрелость BMDC
1) Повторно высеяли BMDC, собранные на этапе 2.4, и добавили рекомбинантный мышиный GM-CSF (1000 Ед/мл) и ИЛ-4 (1000 Ед/мл), а также ЛПС (1-10 мкг/мл) к системе культуры
2) Выращено при температуре 37℃, 5% CO22 инкубатор на 2 дня для получения зрелых BMDC.
3.3【Метод приготовления массы BMDC】-Метод Лутца
【Фон】
а. Метод Лутца похож на метод Сона, и оба метода позволяют получать BMDC в больших количествах, но метод Лутца используется более широко, чем метод Сона.
б. Этот метод позволяет получить больше BMDC, до 1-3 x 108 DC/мышь, и чистота может достигать 90-95%;
в. Концентрация цитокинов, используемая в этом методе, намного ниже, чем в методе Сона, всего 200 Ед/мл, и он падает до 30-100 Ед/мл с 8-го по 10-й день культивирования, что позволяет значительно сэкономить на расходах реагентов;
г. Самое большое различие между этим методом и классическим методом Инабы и методом Сона заключается в том, что клетки костного мозга культивируются в чашке для бактериальной культуры (чашке Петри) вместо чашки для клеточной культуры. Инаба объяснил, что чашка для бактериальной культуры не позволяет макрофагам в костном мозге легко прилипать к стенке, тем самым подавляя развитие макрофагов и избегая ингибирующего эффекта макрофагов на созревание ДК. Это может быть основной причиной, по которой этот метод позволяет получать большое количество ДКМ при более низкой плотности посева.
е. Однако время культивирования этого метода относительно долгое и требует 10-12 дней. С одной стороны, это делается для получения большего количества BMDC. С другой стороны, большинству гранулоцитов и лимфоцитов трудно выживать в течение столь длительного времени, поэтому чистота полученных в конечном итоге BMDC может быть улучшена;
ф. Этот метод использует только GM-CSF для индукционной культуры, а полученные BMDC содержат как незрелые, так и зрелые DC. Для дальнейшего улучшения зрелости необходимо использовать LPS или TNF-α в течение еще 1-2 дней индукции, и содержание зрелых клеток DC достигнет 50-70%.
【Этапы выращивания】
3.3.1 Получение клеток костного мозга мыши
См. соответствующие этапы в методе Инабы (модифицированном) и обратите внимание, что этап гемолиза следует пропустить.
3.3.2 Масштабная подготовка BMDC
1) Подсчитайте количество клеток костного мозга мыши, полученных на этапе 1, и доведите концентрацию клеток до 2×105/мл с полной культуральной средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS;
2) Разложите в чашки Петри диаметром 100 мм для бактериальной культуры (чашки Петри), по 10 мл клеток на чашку, и добавьте рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (200 Ед/мл) и культивирование при температуре 37℃, 5% CO2 в инкубаторе;
[Примечание] Здесь используются чашки Петри для культивирования бактерий, а не клеток.
3) На 3-й день добавьте 10 мл полной питательной среды, содержащей 20 нг/мл рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ в чашку Петри;
4) На 6-й и 8-й дни замените половину среды, то есть соберите старую питательную среду, ресуспендируйте клеточный осадок в полной питательной среде, содержащей 20 нг/мл рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ после центрифугирования, а затем поместить клеточную суспензию обратно в исходную чашку;
5) На 10-й день можно собирать клетки, которые представляют собой BMDC.
3.3.3 Полное созревание BMDC
1) Соберите суспензию клеток, осторожно продувая ДК на 10-й день культивирования пипеткой, и центрифугируйте при 300xg в течение 5 минут при комнатной температуре;
2) Удалите супернатант, ресуспендируйте клеточный осадок в 10 мл полной культуральной среды RPMI 1640, а затем распределите его на планшете для клеточной культуры диаметром 100 мм;
3) Добавить рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (100 Ед/мл) и ФНО-α (500 Ед/мл), или рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ (100 Ед/мл) и ЛПС (1 мкг/мл);
4) Продолжайте культивировать при температуре 37℃, 5% CO2.2 инкубатор на 1-2 дня.
4. Идентификация BMDC
л Морфологическое наблюдение: большинство BMDC растут колониями, а клетки имеют множественные дендритные выступы, которые более заметны у зрелых BMDC.
л Анализ фенотипа клеток: Проточная цитометрия использовалась для обнаружения экспрессии молекул CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC класса II (IA/IE) на поверхности клеток DC. BMDC в высокой степени экспрессируют эти молекулы, и экспрессия этих молекул в полностью зрелых BMDC будет еще больше увеличена.
л Смешанная лимфоцитарная реакция (СЛР): BMDC обладают сильной стимулирующей способностью, и чем выше уровень зрелости, тем сильнее стимулирующая способность.
5. Как выбрать стимулятор созревания?
LPS, CD40L и TNF-α являются широко используемыми и эффективными индукторами созревания как человеческих, так и мышиных DC. TNF-a обладает самой слабой способностью индуцировать созревание DC среди трех. LPS и CD40L являются сильными индукторами полного созревания DC in vitro. Созревание DC, индуцированное обоими, схоже, но спектр индуцированных цитокинов отличается. Зрелые BMDC, индуцированные CD40L, демонстрируют самую сильную иммунорегуляторную способность in vivo, включая генерацию защитных и терапевтических иммунных ответов опухолей. Концентрация, используемая для стимуляции полного созревания DC с помощью LPS, обычно составляет 1-10 мкг/мл, но на самом деле 0,1 мкг/мл имеет очень сильный эффект, но для страховки 1 Обычно используется мкг/мл. Следует отметить, что молекулы CD40L относятся к семейству лигандов TNF, которое характеризуется тем, что они могут функционировать только после образования тримеров. Поэтому лучше всего использовать рекомбинантный белок тримера CD40L для стимуляции ДК, что даст хороший эффект. Если для стимуляции ДК использовать мономеры CD40L, то в большинстве случаев зрелость не очень высокая.
6. Выбор метода обучения
Таблица 1.Сравнение трех распространенных экспериментальных методов получения BMDC
| Параметр | Классический метод культивирования BMDC - метод Инаба | Крупномасштабная подготовка BMDC - метод Сон | Крупномасштабная подготовка BMDC - метод Лутца |
| Количество цитирований в PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Гемолиз костного мозга, лизис эритроцитов | ДА | ДА | Нет |
| Костный мозг сначала удаляет лимфоциты | ДА | Нет | Нет |
| Удаление гранулоцитов во время культивирования | ДА | Нет | Нет |
| Первоначальный объем посева клеток костного мозга | 1мл | 15мл | 10мл |
| Инкубатор | 24-луночные планшеты для клеточных культур | 6-луночный планшет для клеточной культуры | Бактериальная культуральная чашка диаметром 100 мм |
| Питательная среда | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Концентрация мышиного GM-CSF | 200-1000 Ед/мл | Начальная добавляемая концентрация составляет 125-1000. Ед/мл На 4-й и 7-й дни в культуральную систему добавляют достаточное количество ГМ-КСФ и ИЛ-4. | Начальная добавленная концентрация составляет 200 Ед/мл.3-100 Ед/мл после 10-го дня |
| Мышиный ИЛ-4 | Не нужно | Нуждаться，Концентрация такая же, как у GM-CSF. | Не нужно |
| Метод обмена жидкости | На 2-й и 4-й день удалите 50–75 % старой культуральной среды (содержащей клетки) и замените ее свежей полной культуральной средой, содержащей достаточное количество ГМ-КСФ. | / | На 3-й день добавляли равный объем полной питательной среды, содержащей GM-CSF. На 6-й, 8-й и 10-й дни половину среды заменяли. Старую питательную среду (содержащую клетки) аспирировали, центрифугировали, ресуспендировали в свежей полной питательной среде, содержащей GM-CSF, а затем клали обратно. |
| Время культивирования перед пассированием (расширением) | 6 дней | 7 дней | 10 дней |
| Время культивирования после пассирования (созревание) | 2 дня | Никто | 1-2 дня |
| Индуктор полной зрелости | ФНО-ɑ（250 Ед/мл） | ЛПС(1-10 мкг/мл) | ФНО-ɑ（250 Ед/мл）или ЛПС(1 мкг/мл) |
| Время сбора клеток постоянного тока | 7-8 дней | 7-8 дней | 10-13 дней |
| Чистота постоянного тока | День 8：60-70% | День 7：85-95% | День 10-12：80-90% |
| Производство DC/мышь | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Рекомендуемые реагенты для культивирования ДК
| Название продукта | Кот | Размер |
| 91108ЭС | 5 мкг/50 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| 90144ES | 5 мкг/50 мкг/100 мкг/500 мкг | |
| 90621ES | 5 мкг/20 мкг/50 мкг/500 мкг | |
| 94016ES | 25 мкг/100 мкг/500 мкг |