Однако T4 DNA Ligase все еще сталкивается с некоторыми проблемами в практических приложениях, включая плохую стабильность, высокую степень лигирования адаптер-адаптер или низкий выход библиотеки ДНК. Эти проблемы могут привести к снижению экспериментальной эффективности, снижению качества данных, плохой повторяемости экспериментальных результатов и низкой чистоте продукта, тем самым влияя на общую эффективность экспериментов по молекулярной биологии и точность данных секвенирования. Для решения этих проблем Yeasen, на основе инновационного ZymeEditor своей дочерней компании Molefuture^™ Платформа эволюции ферментов провела эволюцию фермента на основе ДНК-лигазы Т4.

Рис. 1. Схематическая диаграмма принципа реакции ДНК-лигазы Т4.^[1]

Рис. 2 Структура ДНК-лигазы Т4

Помимо рационального дизайна, направленная эволюция ДНК-лигазы Т4 проводилась методом MTPS путем скрининга стабильности, активности и остаточной активности. И библиотека из более чем 10⁴ мутантов. После тщательного анализа данных мутаций были отобраны перспективные кандидаты для очистки и строгого тестирования. Затем все победители, полученные с помощью рационального дизайна и направленной эволюции, прошли детальную характеристику после уточненной очистки, включающую оценки активности, стабильности, самолигирования адаптеров, самолигирования фрагментов ДНК и выхода ДНК. На основе мутантов G1 команда провели перетасовку ДНК и комбинированное направленное проектирование мутаций для получения исключительных мутантов, отвечающих разнообразным требованиям применения.

От мутанта до рыночного продукта с несколькими раундами проверки последовательности

The ZymeEditor^ТМ Платформа эволюции ферментов успешно разработала мутант ДНК-лигазы Т4 с высокой термостабильностью, высоким выходом библиотеки и низким самолигированием адаптера с помощью технологии эволюции ферментов. В настоящее время успешно запущена в производство усовершенствованная ДНК-лигаза Т4 — универсальная ДНК-лигаза Т4 Hieff® (600 ед./мкл) (кат. № 12996ES). Этот продукт превосходит традиционную ДНК-лигазу Т4 дикого типа по эффективности лигирования и термостабильности и был проверен методом высокопроизводительного секвенирования, что гарантирует превосходное качество.

Представление данных

1. Более высокая термическая стабильность

Мутанты ДНК-лигазы Т4 от Yeasen подвергались термической обработке при 42℃. в течение 0, 2 и 4 часов и сравнивались с ДНК-лигазами T4 от поставщиков Q, N, A и T.Затем была создана библиотека ДНК всего генома с использованием 1 мкг фрагментированной бычьей геномной ДНК с использованием набора для создания библиотеки ДНК Yeasen (кат. № 12927ES) для сравнения термостабильности ДНК-лигазы Т4.

Рис. 3. Испытание на термостойкость при 42℃

Результаты:

Термическая стабильность: Yeasen ≈ Поставщик N ≈ Поставщик A > Поставщик T > Поставщик Q.

2.Более высокая производительность библиотеки

Мутант ДНК-лигазы T4 от Yeasen был протестирован на выход библиотеки как при высоких, так и при низких уровнях входной ДНК по сравнению с ДНК-лигазами T4 от поставщиков Q, N, A и T. Был использован набор для создания библиотеки ДНК Yeasen (каталожный номер 12927ES), при этом для создания библиотек ДНК использовались 1 мкг и 0,5 нг фрагментированной бычьей геномной ДНК.

Рис. 4 Анализ выхода библиотеки ДНК

Результаты:

Выход библиотеки (1 мкг геномной ДНК): Yeasen > Поставщик Q ≈ Поставщик T ≈ Поставщик A > Поставщик N. Выход библиотеки (0,5 мкг геномной ДНК): Yeasen ≈ Поставщик Q ≈ Поставщик A ≈ Поставщик T > Поставщик N.

3. Самолигирование нижнего адаптера

Мутант ДНК-лигазы T4 от Yeasen сравнивали с ДНК-лигазами T4 от Vendor Q, N, A и T для самолигирования адаптера. Использовался набор для создания библиотеки ДНК Yeasen (Cat#12927ES) с 0 нг и 0,5 нг фрагментированной бычьей геномной ДНК в качестве входных данных для построения полногеномных библиотек ДНК.

Рис. 5. Данные самолигирования адаптера с 0 нг (слева) и 0,5 нг (справа) вводимой геномной ДНК

Результаты:

1) Скорость самолигирования адаптера (0 нг гДНК): Поставщик N > Yeasen > Поставщик T > Поставщик A > Поставщик Q.

2) Скорость самолигирования адаптера (0,5 нг гДНК): Yeasen > Поставщик T > Поставщик Q ≈ Поставщик N > Поставщик A.

Связаться с нами

Yeasen успешно преодолел ограничения традиционных ДНК-лигаз T4, предложив продукт ДНК-лигазы T4, который отличается термической стабильностью, выходом библиотеки и самолигированием адаптера. В ходе этого процесса компания накопила богатую библиотеку мутантов, предоставляя исследователям множество вариантов для удовлетворения различных экспериментальных потребностей. Если вас интересуют наши продукты или мутанты ДНК-лигазы T4, пожалуйста, свяжитесь с нами следующими способами.

Электронная почта: order1@yeasen.com (НАС)

Телефон: +1 240-472-6069 (США)

Кроме того, Yeasen предлагает ряд продуктов серии T4 DNA ligase. Нажмите на ссылку продукта, чтобы узнать информацию о продукте

Ссылки

[1] Шуман С. ДНК-лигазы: прогресс и перспективы[Дж].Журнал биологической химии, 2009, 284(26):17365-17369.