РНКаза HII, также известная как РНКаза H2, является эндорибонуклеазой, которая специфически нацеливается и разрывает фосфодиэфирную связь на 5'-конце одиночного рибонуклеотида, расположенного внутри двухцепочечной спирали ДНК, образуя 5'-фосфат и 3'-гидроксильную группу (рис. 1). Этот фермент проявляет минимальную активность расщепления по отношению к одноцепочечной РНК и неактивен как против двухцепочечной ДНК (dsDNA), так и против одноцепочечной ДНК (ssDNA). Функционально активная в диапазоне температур от 50°C до 75°C, РНКаза HII достигает пиковой производительности при температурах от 70°C до 75°C. Используя свою уникальную способность выполнять целевое односайтовое расщепление на участках ДНК, где интегрирован рибонуклеотид, не затрагивая dsDNA или ssDNA, RNase HII служит точным «триггером» для инициации реакции, включая активацию и удлинение праймера, для достижения специфической амплификации. Этот фермент играет ключевую роль в RNase H-зависимой ПЦР (rhPCR), технологии петлевой изотермической амплификации (LAMP) и деградации компонентов РНК во фрагментах Оказаки.
Рис. 1. Схематическая диаграмма принципа реакции РНКазы HII
Функциональное применение РНКазы HII
一. ПЦР, зависимая от РНКазы H(рчПЦР)
rhPCR включает РНКазу HII и специально разработанные, закрытые расщепляемые праймеры rhPCR в процесс ПЦР. Этот подход использует уникальное свойство РНКазы HII селективно гидролизовать РНК в гибридах ДНК-РНК, оставляя фосфодиэфирные связи в одноцепочечной или двухцепочечной ДНК и РНК нетронутыми. В результате РНКаза HII только расщепляет гибрид ДНК-РНК и допускает удлинение праймера, когда праймер идеально комплементарен целевой последовательности ДНК. Это целенаправленное действие значительно повышает точность реакции. РНКаза HII является единственным ферментом, способным инициировать точное удаление рибонуклеотидов, не вызывая мутаций путем расщепления на 5'-конце рибонуклеиновой кислоты. Благодаря своей высокой специфичности, чувствительности и воспроизводимости rhPCR предлагает явные преимущества в таких приложениях, как обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов (SNP), типирование генов, одновременное обнаружение нескольких целей и анализ нуклеиновых кислот окружающей среды.
Технический маршрут
1. Проектирование праймера
Конструкция праймера должна обеспечивать, чтобы температура плавления после резки была выше температуры отжига, чтобы гарантировать стабильное связывание праймера с шаблоном во время циклов ПЦР. Праймер rhPCR состоит из трех частей:
1) 5'-сегмент ДНК: сопоставимый по длине и требованиям к температуре плавления (Tm) со стандартными праймерами ПЦР, он может эффективно соединяться с шаблоном ДНК и удлиняться от него после разрезания ферментом РНКазой HII.
2) Одно основание РНК: обеспечивает сайт разрезания для РНКазы HII.
3) 3'-сегмент ДНК: длина из четырех или пяти оснований с блокатором, обычно короткой, неудлиняемой молекулой, такой как пропиленгликоль, которая предотвращает удлинение ДНК-полимеразы до тех пор, пока блокатор не будет удален.
2. Резка и удлинение
В начале реакции rhPCR праймер и матрица ДНК свободны. Когда праймер связывается со специфической гетеродуплексной матрицей РНК:ДНК, основание РНК с 5'-стороны заблокированного праймера распознается и разрезается ферментом РНКазой HII, оставляя олигонуклеотид ДНК с 3'-гидроксильной группой, что обеспечивает отправную точку для удлинения ДНК-полимеразы. Затем следует обычный процесс ПЦР-амплификации.
Рис 2. Схема принципа рчПЦР [1]
Да.Петлевая изотермическая амплификация (LAMP)
Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — это простой и быстрый метод амплификации генов, который позволяет амплифицировать нуклеиновые кислоты в изотермических условиях за короткий промежуток времени. Однако из-за инициации активности ДНК-полимеразы во время подготовки при комнатной температуре образуются неспецифические несоответствия, которые могут привести к небольшому количеству непарных праймеров и димеров праймеров, вызывая незначительные загрязнения, которые могут привести к ложноположительным результатам.
Применение РНКазы HII к системе амплификации LAMP может эффективно решать проблему ложных положительных результатов в технологии LAMP, расширяя ее применение в клинической диагностике. Как показано на рис. 3, метод LAMP с активацией праймера (PA-LAMP) с использованием РНКазы HII, когда праймер спаривается с целевой одноцепочечной ДНК, фермент РНКаза HII специфически расщепляет РНК на праймере, активируя его и позволяя удлинять праймер, достигая специфической амплификации и эффективно снижая ложные положительные результаты в системе.
Рис 3. Принципиальная схема принципа работы PA-LAMP [2]
YEASEN РНКаза HII
РНКаза HII YEASEN (Кат.№14539) происходит от Pyrococcus abyssi, Па, и он свободен от загрязняющих нуклеаз, никирующих ферментов и остатков РНКазы, с низким загрязнением ДНК хозяина, что эффективно снижает ложные срабатывания в системе. РНКаза HII от YEASEN чрезвычайно термостойка, сохраняя свою активность даже после 30 минут при 95°C, что делает ее совместимой с различными системами реакций rhPCR, а также подходит для LAMP и других приложений.
1. Кишечная палочка Остаток геномной ДНК < 0,5 копий/100 ед.
Обнаружение кишечная палочка Остаток геномной ДНК в различных партиях РНКазы HII показал, что остаток геномной ДНК хозяина РНКазы HII YEASEN намного ниже 0,5 копий/100 ед.
Рис 4. Обнаружение кишечная палочка остаток геномной ДНК
2. Испытание на термостойкость при 95°C
После нагревания РНКазы HII при 95°C в течение 0–45 минут была протестирована активность фермента РНКазы HII. Результаты показали, что потери активности фермента в РНКазе HII YEASEN практически не наблюдалось даже после 45 минут нагрева.
Рис. 5. Испытание на термостойкость при 95°C
3. Отсутствие экзонуклеазы, никирующего фермента или остатка РНКазы (доза 1 ед.)
Инкубация 1 ед. различных партий РНКазы HII с соответствующими субстратами ДНК/РНК при 37°C в течение 4 часов показала, что электрофорез в агарозном геле не содержит экзонуклеазы, никирующего фермента или остатка РНКазы в РНКазе HII.
Рис. 6.Результаты обнаружения экзонуклеазы, никирующего фермента и остатка РНКазы
Рекомендуемые сопутствующие товары
| Применение продукта | Название продукта | Номер по каталогу |
| rhPCR、LAMP | 14539ES 14541ES | |
| рчПЦР | 10101ES | |
| РТ-ЛАМПА | 14402ES | |
| 11111ES |
Ссылки
[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием блокированных расщепляемых праймеров. BMC Biotechnol. 2011 10 августа;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.
[2] Du WF, Ge JH, Li JJ и др. Одношаговое высокоспецифичное обнаружение мутации одного нуклеотида с помощью изотермической амплификации, активируемой праймером (PA-LAMP)[J]. Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.