Рисунок 1. Схематическая диаграмма расщепления ДНКазой I двухцепочечной ДНК в присутствии Mg²⁺ и Мн²⁺

Обычная ДНКаза I в основном очищена из поджелудочной железы крупного рогатого скота или является рекомбинантным ферментом. По сравнению с ДНКазой I, очищенной из поджелудочной железы крупного рогатого скота, рекомбинантная ДНКаза I имеет относительно более низкие уровни эндогенной РНКазы или может быть сформулирована как продукты без РНКазы, что делает ее более подходящей для приложений, чувствительных к РНКазе, таких как удаление ДНК из образцов РНК.

Приложения

Что касается приложений, ДНКаза I хорошо известна своим использованием в экспериментах, связанных с поддержанием целостности РНК, таких как извлечение РНК без ДНК, подготовка матриц РНК без геномной ДНК перед обратной транскрипцией и деградация матриц ДНК после транскрипции in vitro. Кроме того, ее можно использовать для переваривания ДНК-зондов при удалении рРНК, для маркировки ДНК посредством ник-трансляции, анализа ДНК-белковых взаимодействий с использованием метода футпринтинга, создания случайных библиотек ДНК, снижения вязкости клеточных лизатов или белковых экстрактов, переваривания клеточных адгезий в качестве добавки в клеточной культуре и частичного расщепления геномной ДНК в качестве положительного контроля в анализах TUNEL для обнаружения апоптоза. Подводя итог, ДНКазу I можно использовать практически в любом приложении, требующем ферментативного переваривания ДНК. Ниже будет представлено краткое введение в несколько распространенных приложений.

• Удаление геномной ДНК перед экстракцией РНК или обратной транскрипцией

РНК, как часто изучаемый образец в лабораториях, сильно влияет на качество экспериментальных данных из-за своего собственного качества. Как правило, невозможно полностью избежать остатков геномной ДНК в процессе извлечения РНК. Поэтому перед проведением сложных последующих приложений (таких как анализ экспрессии мРНК, анализ транскриптома и т. д.) обычно рекомендуется обработать образцы РНК ДНКазой I для расщепления остатков геномной ДНК. Расщепление геномной ДНК может проводиться во время извлечения РНК, после извлечения РНК или перед обратной транскрипцией РНК.

Рисунок 2. Процесс удаления геномной ДНК с использованием ДНКазы I

• Удаление шаблонной ДНК при транскрипции in vitro

Транскрипция in vitro (IVT) в первую очередь использует ДНК в качестве матрицы для получения РНК под воздействием соответствующих субстратов и буферов. Обычно используемые в этом процессе РНК-полимеразы включают T7, T3 и SP6, которые отвечают за катализ синтеза РНК. Однако синтезированный продукт РНК может содержать остатки ДНК, и устранение этих остатков полезно для последующих экспериментов.

Особенно в процессе разработки вакцин на основе мРНК удаление этих остатков ДНК является критически важным шагом, который напрямую влияет на сложность последующих процессов очистки и чистоту конечного продукта.Для эффективного устранения шаблонной ДНК обычно используют ДНКазу I, чтобы гарантировать, что образец РНК свободен от остатков ДНК. Этот шаг помогает повысить общую точность и эффективность эксперимента.

Рисунок 3: Процесс транскрипции in vitro с использованием линеаризованной плазмиды в качестве матрицы^[4]

• Удаление рРНК при построении и секвенировании библиотеки РНК

В организмах рРНК очень распространена и высококонсервативна, что не имеет большого значения для получения биологической информации в исследованиях. Однако 95% всей РНК, извлеченной во время экспериментов, составляет человеческая рРНК, и присутствие этих рРНК может помешать обнаружению целевых РНК. Поэтому при подготовке и секвенировании библиотеки РНК рРНК обычно удаляется первой. В настоящее время основным методом удаления рРНК является переваривание РНКазой, а его основной операционный Шаги и принципы следующие:

1. Извлечение общей РНК;
2. Гибридизировать одноцепочечные ДНК-зонды с молекулами рРНК (Примечание: разработать и синтезировать одноцепочечные ДНК-зонды, специфичные к рРНК);
3. РНКаза H разрушает гибридизованную рРНК;
4. ДНКаза I разрушает ДНК-зонды;
5. рРНК успешно удаляется, оставляя после себя не-рРНК-матрицы РНК.

Рисунок 4: Схематическая диаграмма принципа удаления рРНК на основе ферментативного метода.^[5]

• Перевод ника для маркировки ДНК

Трансляция ник-кода является наиболее часто используемым методом маркировки зондов дезоксирибонуклеиновой кислоты в лаборатории. Этот метод достигается за счет комбинированного действия ДНКазы I и E.coli ДНК-полимераза I.

Основной принцип заключается в следующем:

1. Во-первых, используйте соответствующую концентрацию ДНКазы I, чтобы создать несколько одноцепочечных разрывов в каждой цепи двухцепочечной ДНК, которую необходимо пометить, образуя 3'-гидроксильные концы в местах разрывов.
2. Затем используйте 5'→3' экзонуклеазную активность кишечная палочкаДНК-полимераза I удаляет нуклеотид с 5'-конца разрыва, в то время как 5'→3'-полимеразная активность Э. кишечная палочка ДНК-полимераза I вводит меченый нуклеотид в 3'-конец разрыва, чтобы исправить его. По мере того, как разрыв движется вдоль цепи ДНК, меченые нуклеотиды включаются в новосинтезированную цепь ДНК.

Рисунок 5: Схематическая диаграмма принципа маркировки ДНК с помощью ник-трансляции^[6]

• Эксперимент по исследованию футпринтинга ДНКазы I

Анализ футпринтинга ДНКазы I — это точный метод идентификации участков связывания ДНК-связывающих белков на молекулах ДНК. Принцип заключается в том, что белки, связанные с фрагментом ДНК, защищают связанный регион от деградации ДНКазой I. После ферментативного расщепления оставшийся фрагмент («футпринт») можно использовать для определения его последовательности. На изображении геля нет полос, соответствующих регионам, где связан белок.

Основной принцип заключается в следующем:

1. Пометьте одноцепочечные концы двухцепочечной молекулы ДНК, подлежащей тестированию.
2. Смешайте белок с ДНК и добавьте соответствующее количество ДНКазы I для ферментативного расщепления, образуя фрагменты ДНК различной длины.Количество фермента следует контролировать, чтобы гарантировать, что соседние фрагменты ДНК отличаются только одним нуклеотидом, а параллельно следует включить контроль без добавления белка.
3. Удалите белок из ДНК, отделите денатурированную ДНК с помощью электрофореза в ПААГ и сделайте авторадиографию для интерпретации нуклеотидной последовательности области отпечатка путем сравнения с контрольной группой.

Рисунок 6: Схематическая диаграмма принципа анализа футпринтинга ДНКазы I.^[7]

The ДНКаза I Руководство по выбору Йесен

Для удовлетворения различных потребностей приложений Yeasen предлагает рекомбинантный ДНКаза I в кишечная палочкаи может предоставить ДНКазу I класса GMP для удовлетворения требований транскрипции мРНК in vitro и других применений.

Позиционирование продукта	Приложение	Название продукта	номер по каталогу
Свободный от РНКазы	удаление ДНК из РНК и белковых препаратов	Рекомбинантная ДНКаза I (без РНКазы)	10325ES
GMP-класса, Свободный от РНКазы	Транскрипция мРНК in vitro	Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) UCF.ME®, класс GMP	10611ES

Ссылки

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L и др. ДНК ВПЧ, мРНК E6/E7 и обнаружение p16INK4a при раке головы и шеи: систематический обзор и метаанализ [J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Брокколо Ф., Фузетти Л., Розини С. и др. Сравнение вирусной нагрузки ДНК онкогенного типа ВПЧ и обнаружения мРНК E6/E7 в образцах шейки матки: результаты многоцентрового исследования [J]. Журнал медицинской вирусологии, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Хуан З., Фаско М.Дж., Камински Л.С. Оптимизация удаления ДНК-азой I загрязняющей ДНК из РНК для использования в количественной РНК-ПЦР [J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Кан ДД, Ли Х, Донг И. Достижения in vitro транскрибированной мРНК (IVT мРНК) для обеспечения возможности перевода в клинику [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Вайм И., Реми С., Свеннен Р. и др. Необратимая тепловая инактивация ДНКазы I без деградации РНК [J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Адольф С., Хамейстер Х. In situ nick-трансляция метафазных хромосом с меченым биотином d-UTP [J]. Генетика человека, 1985, 69: 117-121.

[7] Сонг С., Чжан С., Хуан Х. Выбор подходящего метода для идентификации точек начала репликации в микробных геномах. Фронт Микробиол, 2015, 6: 1049.