С быстрым развитием ппротеин сcience, технология очистки белков играет все более важную роль в области биологических исследований и биотехнологической промышленности. В качестве основного метода она включает в себя интеграцию кодирующей информации целевого белка в клетки-хозяева с помощью методов генной инженерии, чтобы их можно было заставить эффективно производить требуемые белки. Затем выполняется ряд сложных этапов работы in vitro для достижения высокочистой экстракции белков. Очистка белков позволяет ученым изолировать отдельные типы белков, что имеет решающее значение для углубленных исследований структуры и функций белков, разработки новых лекарств, диагностики заболеваний и продвижения применения биотехнологии. Эта технология не только обеспечивает точность научных экспериментов, но и непрерывно стимулирует развитие наук о жизни.
Рисунок 1. Принципиальная схема аффинной хроматографии[1]
В области белковой инженерии теги слияния служат мощным инструментом, который может облегчить различные экспериментальные цели путем связывания с целевыми белками. Функции распространенных тегов слияния перечислены в таблице ниже для справки. Однако, как только эти метки остаются на белках слияния после выполнения своих первоначальных вспомогательных функций, они могут оказывать неблагоприятное воздействие на последующие эксперименты, например, мешать иммунологическим экспериментам на животных или влиять на биологическую активность белков. Поэтому крайне важно удалить эти ненужные метки слияния, чтобы обеспечить нормальное функционирование белков и точность экспериментов.
Таблица 1. Введение в функции общих меток слияния и методы ферментативного расщепления
| Тег Fusion | Размер (КД)а) | Функция | Распространенные методы ферментативного расщепления |
| Его | 0,84 | Полезен для очистки, способен очищать растворимые белки/белки включений. | Протеаза TEV |
| Флаг | 1.01 | Целевой белок, слитый с Fотставание Тег может быть распознан антителом против Fотставание, так что белок слияния, содержащий Fотставание Тег можно обнаружить и идентифицировать с помощью вестерн-блоттинга, ИФА и других методов. | Энтерокиназа |
| НДС | 26 | Улучшает растворимость белков, способен очищать только растворимые белки и защищать токсичные белки. | Тромбин |
| МБП | 44.4 | Улучшить растворимость белка и защищают токсичные белки. | Протеаза TEV |
| Нуса | 55 | Улучшить растворимость белка и защищают токсичные белки. | Тромбин |
| СУМО | 11.2 | Улучшает растворимость белков, способствует протеолитическому расщеплению белков гидролиз и улучшение стабильности белков. | СУМО-протеаза |
Сегодня мы рады представить вам передовой продукт для эффективного и точного удаления термобигов - UCF.ME.ТМ Протеаза rTEV. Благодаря простой и легкой в использовании экспериментальной процедуре этот фермент может легко отщеплять ненужные метки от белков слияния, тем самым получая высокочистые целевые белки.
UCF.MEТМ Протеаза rTEV
TEV Protease — это протеаза, широко используемая для расщепления рекомбинантных белковых слитых тегов, известная своей высокой сайт-специфичностью. Она строго распознает последовательность из семи аминокислот EXXYXQ↓(G/S) и выполняет точное расщепление между глутамином и глицином или серином. Наиболее распространенная последовательность из семи аминокислот — Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Эта специфичность обеспечивает точность и эффективность процедуры обработки белка.
Рисунок 2. Схематическая диаграмма механизма действия протеазы TEV[2]
UCF.MEТМ rTEV Protease — это рекомбинантная протеаза, которая была генетически сконструирована и тщательно очищена. Она не только сохраняет полную функциональную активность природного фермента TEV, но и демонстрирует превосходную стабильность и специфичность в более широком диапазоне температур. The остаток ДНК хозяина из тего продукт - очень низкая, что обеспечивает более высокую эффективность резки меток слияния белков в практических приложениях и эффективно снижает риск введения остатков экзогенных веществ. UCF.MEТМ rTEV Protease проявляет оптимальную активность в условиях pH 7,0 и 30°C. Однако она сохраняет активность даже в широком диапазоне условий с pH 6,0-8,5 и температурой 4-30°C, чтобы соответствовать различным требованиям обработки белка. Стоит отметить, что UCF.MEТМ Протеаза rTEV имеет метку 6×His на N-конце, которую можно эффективно удалить с помощью смолы Ni-NTA, тем самым достигая точной очистки целевого белка.
Дисплей производительности
1. Высокая эффективность расщепления: белковая метка расщепляется более тщательно.
Использование белка слияния (3 мкг), содержащего UCF.MEТМ Сайт расщепления протеазы rTEV в качестве субстрата, UCF.MEТМ Добавляли rTEV Protease в количестве 10, 5 и 3 U соответственно, и реакцию проводили при 30°C в течение 1 ч. Эффект расщепления определяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Результаты показали, что YоблегчитьUCF.MEТМ Протеаза rTEV могла эффективно расщеплять субстрат, когда входное количество составляло более 3 ед., с эффективностью расщепления >90%.
Рисунок 3. Проверка активности расщепления UCF.MEТМ Протеаза rTEV
2. Низкий уровень остатков геномной ДНК хозяина: эффективное снижение риска введения остатков экзогенных веществ
Тестируя хост (кишечная палочка) остатки геномной ДНК в различных партиях UCF.MEТМ Протеаза rTEV, результаты показали, что остаток геномной ДНК хозяина UCF.MEТМ Протеаза rTEV была намного ниже <1 копии/ед.
Рисунок 4. Результаты остатков геномной ДНК хозяина в UCF.MEТМ Протеаза rTEV
3. Широкие условия применения: Способен удовлетворить различные требования к переработке белка.
Проверяя активность расщепления UCF.MEТМ Результаты исследования протеазы rTEV в различных условиях показали, что UCF.MEТМ Протеаза rTEV проявила высокую активность в условиях 4–30 °C, что может удовлетворить различные требования заказчиков к применению.
| Время реакции (час) | Активность расщепления при различных температурах (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Иоблегчитьрекомендуемые теги fusion резки белковые продукты
| Продукт Имя | Продукт Нумбра | |
| ТЭВ Протеаза | UCF.MEТМ Протеаза rTEV | 20427ЭС |
| Энтерокиназа | Энтерокиназа, рекомбинантная | 20395ES |
| СУМО-протеаза | СУМО-протеаза | 20410ES |
| 3C Протеаза | 3C Протеаза | 20409ES |
Ссылки：
[1] Парих И., Куатрекасас П. Аффинная хроматография[J]. Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Page R C. Анализ подавления флуоресценции для определения активности протеазы TEV [J]. Аналитическая биохимия, 2022, 659: 114954.