ДНКаза I и ее применение в биомедицине
Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) — это эндонуклеаза, ее применение заключается не только в поддержании целостности РНК, но и в анализе ДНК-отпечатков, создании случайных библиотек ДНК, снижении липкости клеточных лизатов или белковых экстрактов и т. д. Одним словом, ДНКаза I может использоваться практически в любом приложении, требующем ферментативного расщепления ДНК. Ниже приводится подробное введение в ДНКазу I и ее конкретное применение.
1. Что такое ДНКаза I?
2. ДНКаза I для приготовления РНК-экстракции без ДНК
3. ДНКаза I для транскрипции in vitro для удаления шаблонной ДНК
4. ДНКаза I для удаления рРНК
5. ДНКаза I для маркировки ДНК
6. Другие приложения
7. Руководство по выбору продукта ДНКазы I
1. Что такое ДНКаза I?
Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) неспецифическая эндонуклеаза, способная расщеплять одно- или двухцепочечную ДНК, присутствующую в различных тканях и жидкостях организма. Она может гидролизовать фосфодиэфирные связи с образованием моно- и олигодезоксинуклеотидов, содержащих 5'-фосфатную группу и 3'-ОН группу. Оптимальный рабочий диапазон pH ДНКазы I составляет 7-8, ее активность зависит от Ca2+, и она может активироваться двухвалентными ионами металлов, такими как Mn2+, Mg2+, Zn2+ и т. д. В присутствии Mg2+ ДНКаза I случайным образом разрезает любой участок двухцепочечной ДНК; в присутствии Mn2+ ДНКаза I может разрезать двухцепочечную ДНК в том же месте, образуя тупой конец или липкие концы длиной 1-2 нуклеотида.
Рисунок 1. Схематическая диаграмма расщепления двухцепочечной ДНК ДНКазой I в присутствии Mg2+ и Mn2+.
Хотя расщепления ДНКазой I обычно считаются неспецифическими расщеплениями, ДНКаза I с большей вероятностью будет действовать на определенные фрагменты последовательности, такие как область малой бороздки, и более склонна к расщеплению пурин-пиримидиновых последовательностей. Однако, когда ДНКаза I действует на гетерогенную dsDNA, все четыре основания будут расщеплены, и эффект на определенное основание не будет более чем в 3 раза больше, чем на другие основания.
2. ДНКаза I для приготовления РНК-экстракции без ДНК
В биологических экспериментах первым шагом является подготовка нуклеиновой кислоты для изучения различных функций РНК. Однако, поскольку ДНК и РНК часто высвобождаются вместе в процессе лизиса клеток, интерференции между ними невозможно избежать, независимо от того, какой раствор для экстракции используется, поэтому для устранения интерференции необходимо использовать специальные ферменты. Для высококачественной экстракции РНК ДНКаза I используется для удаления остаточной ДНК из образца.
ДНКаза I может расщеплять двухцепочечную и одноцепочечную ДНК до олигонуклеотидов и отдельных нуклеотидов, а ДНК в продукте приготовления РНК может быть эффективно расщепляема. Затем ДНКаза I инактивируется нагреванием с помощью стоп-буфера. В процессе нагревания шпилечная структура молекулы РНК может быть раскрыта, что облегчает прямой вход РНК в процесс обратной транскрипции.
Качество РНК напрямую влияет на экспериментальные данные в большой степени. В целом, остатков геномной ДНК невозможно полностью избежать во время извлечения РНК, поэтому обычно рекомендуется обрабатывать образцы РНК ДНКазой I для переваривания остаточной геномной ДНК перед сложными последующими приложениями (например, анализом экспрессии мРНК, анализом транскриптома и т. д.). Этап переваривания геномной ДНК может быть выполнен во время извлечения РНК, после извлечения РНК или перед обратной транскрипцией РНК.По позиционированию продукции компания Yeasen предлагает следующие продукты:
Таблица 1: Список продуктов, связанных с удалением ДНК перед экстракцией РНК или перед обратной транскрипцией
| Позиционирование продукта | Название продукта | Кот # |
| Извлечение РНК | Реагент для извлечения тотальной РНК TRIeasy™ [запросить] | 10606ES |
| 19221ES | ||
| Набор MolPure™ Plant Plus RNA [запросить] | 19292ES | |
| Набор для вирусной ДНК/РНК MolPure™ [запросить] | 19321ES | |
| удаление геномной ДНК | 10325ES | |
| Обратная транскрипция | Hifair™Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix для количественной ПЦР (gDNA digester plus) | 11141ES |
| кПЦР | 11184ES |
3. ДНКаза I для транскрипции in vitro для удаления шаблонной ДНК
Транскрипция in vitro (IVT) в основном использует ДНК в качестве шаблона, а также соответствующие субстраты и буферы для получения РНК посредством транскрипции in vitro. В экспериментах по транскрипции in vitro для синтеза РНК обычно используются РНК-полимеразы, такие как T7, T3 и SP6. Синтезированная РНК может иметь остатки ДНК. Устранение остатков ДНК полезно для разработки последующих экспериментов. Например, на этапе разработки вакцины мРНК удаление остатков является критическим шагом, который может снизить сложность последующей очистки и повысить чистоту продукта. Шаблон ДНК обычно удаляется с помощью рекомбинантной ДНКазы I (без РНКазы).В соответствии с процессом синтеза мРНК, Yeasen предоставляет следующие продукты:
| процесс синтеза мРНК | Название продукта | Кот# |
| Подготовка шаблона | Высокоточная ДНК-полимераза Hieff Canace™ Plus [запросить] | 10148ES |
| Hieff Clone™Универсальный набор для одношагового клонирования | 10922ES | |
| 10125ES | ||
| FuniCut™BsaI [запросить] | 15005ES | |
| FuniCut™ XbaI [запросить] | 15033ES | |
| BspQI[запросить] [запросить] | 16215ES | |
| Транскрипция in vitro | 10623ES | |
| 10624ES | ||
| РНК-полимераза Т7 (50 ед/мкл)[запросить] | 10618ES | |
| 10133ES | ||
| 10620ES | ||
| 10621ES | ||
| Удалить шаблон ДНК | 10611ES | |
| модификация мРНК | Фермент каппинга вируса коровьей оспы UCF.ME™mRNA, соответствующий требованиям GMP | 10614ES |
| 10612ES | ||
| 10132ES | ||
| 10619ES | ||
| очистка мРНК | 12602ES |
4. ДНКаза I для удаления рРНК
In vivo рРНК очень распространена и очень консервативна, что не имеет большого значения для получения биологической информации, поэтому при построении библиотеки РНК и секвенировании рРНК часто удаляют в первую очередь.В настоящее время методом удаления рРНК является в основном переваривание РНКазой H. Основные этапы ферментативного истощения рРНК показаны на рисунке 2:
Рисунок 2: Схематическая диаграмма принципа ферментативного истощения рРНК (Baldwin, A. et al. 2021, Current Protocols)
Сначала извлеките общую РНК, затем гибридизуйте одноцепочечный ДНК-зонд с рРНК, спроектируйте и синтезируйте одноцепочечный ДНК-зонд, специфичный для рРНК, затем используйте РНКазу H для деградации гибридизованной рРНК и используйте ДНКазу I для деградации ДНК-зонда. Наконец, оставьте шаблон РНК, не являющийся рРНК. Продукты, связанные с удалением рРНК, предоставленные Yeasen, следующие:
| процесс синтеза мРНК | Название продукта | Кот# |
| Человек/Мышь/Крыса Истощение рРНК | Hieff NGS™ Набор для удаления рРНК MaxUp (человек/мышь/крыса) MaxUp [запросить] | 12253ES |
| Истощение рРНК растений | 12254ES | |
| Удаление рибосомальной РНК и областей 45S ITS/ETS из общей РНК человека | Hieff NGS™ Набор MaxUp Human rRNA Depletion Kit (рРНК и ITS/ETS) | 12257ES |
| Деградация рРНК | 12906ES | |
| Деградация ДНК-зонда | 10325ES |
5.ДНКаза I для маркировки ДНК
Трансляция ника — один из наиболее часто используемых в лаборатории методов маркировки зондов дезоксирибонуклеиновой кислоты. Этот метод использует различные ферментативные активности ДНК-полимеразы I для включения меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в новые синтезированные цепи ДНК. Таким образом, синтезируются однородно маркированные зонды ДНК для высокой удельной активности. Характеристики трансляции ника — это быстрота, простота, преднамеренность, высокая специфичность и однородно маркированные зонды, которые подходят для более длинной двухцепочечной ДНК.Метод реализуется путем совместного действия ДНКазы I и ДНК-полимеразы I E. coli. Основные этапы маркировки ДНК методом ник-трансляции показаны на рисунке 3:
Рисунок 3: Схематическая диаграмма маркировки ДНК с помощью ник-трансляции
Подходящая концентрация ДНКазы I используется для создания нескольких одноцепочечных разрывов на каждой цепи двухцепочечной ДНК, которую необходимо пометить, и 3'-гидроксильный конец образуется в разрыве. Используйте 5'→3' экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы I E. coli, чтобы вырезать нуклеотид с 5' конца разрыва, и в то же время 5'→3' полимеразную активность ДНК-полимеразы I E. coli, чтобы ввести нуклеотид, помеченный с 3' конца разрыва, чтобы исправить разрыв. По мере того, как разрыв перемещается вдоль цепи ДНК, меченые нуклеотиды включаются в новосинтезированную цепь.Компания Yeasen предлагает следующие продукты, связанные с маркировкой ДНК:
| Позиционирование продукта | Название продукта | Кот# |
| Обычный | Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) из поджелудочной железы быка [запросить] | 10607ES/10608ES |
| Не содержит РНКазы | 10325ES | |
| E.coli источник | 12903ES |
6. Другие приложения
Выше приведены несколько часто используемых приложений. Другие приложения ДНКазы I включают следующее, например, анализ отпечатков ДНКазы I и гиперчувствительные к ДНКазе I сайты. Анализ отпечатков ДНКазы I — это метод обнаружения, который может точно идентифицировать сайты связывания ДНК-связывающих белков на ДНК. Когда белок связывается с фрагментом ДНК, он может защитить сайт связывания от повреждения ДНКазой I, и фрагменты ДНК останутся после ферментативного переваривания («отпечаток»), и их последовательность может быть определена. На изображении геля нет полос, где ДНК связывается с белком. Чтобы узнать больше, нажмите на ссылку.Гиперчувствительные к ДНКазе I сайты относятся к расщеплениям в небольшом количестве определенных сайтов, когда хроматин обрабатывается низкой ДНКазой I, и эти определенные сайты называются гиперчувствительными к ДНКазе I сайтами. Принцип заключается в том, что когда ген находится в транскрипционно активном состоянии, хроматин, содержащий ген, значительно более чувствителен к деградации ДНКазы, чем неактивный регион. Чтобы узнать больше, нажмите на ссылку.
7. Руководство по выбору продукта ДНКазы I
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., основанная в 2014 году, является высокотехнологичным предприятием, занимающимся НИОКР и производством сырья для инструментальных ферментов и антигенных антител. Ее продукция включает молекулярные диагностические ферменты, белки и антитела, используемые в фармацевтике, тестировании безопасности пищевых продуктов, селекции, правосудии и других отраслях. Мы стремимся предоставлять клиентам в области наук о жизни высококачественные продукты и услуги. Руководство по покупке продукта для ДНКазы I следующее:| Название продукта (Кат.№) | Позиционирование продукта | Рекомендуемые приложения |
| ДНКаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота (CAT#10607，10608)[запросить] | РН-аза удалена, не обнаружена | В основном используется в исследованиях белков: удаление ДНК из белковых препаратов. |
| Рекомбинантная ДНКаза I (без РНКазы)(КОД № 10325) | Без РНКазы, для исследований | Идеально подходит для различных применений: удаления ДНК из препаратов РНК и белков, таких как библиотеки кДНК, чувствительные к РНКазе, или подготовки образцов для экспериментов ОТ-ПЦР. |
| UCF.ME™Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) GMP-класса(КОД № 10611) | Не содержит РНКазы, соответствует фармацевтическому стандарту GMP. | Идеально подходит для различных применений: удаления ДНК из препаратов РНК и белков, таких как библиотеки кДНК, чувствительные к РНКазе, или подготовки образцов для экспериментов ОТ-ПЦР. |
По поводу чтения:
Реагенты GMP-класса для синтеза мРНК in vitro
Принципы футпринтинга ДНКазы I и его биомедицинское применение
Ссылки
1. Болдуин А., Моррис А. Р., Мукерджи Н. Простой, экономически эффективный и масштабируемый метод истощения человеческой рибосомальной РНК для РНК-секвенирования [J]. Текущие протоколы, 2021.
2. Сонг Ч., Чжан С., Хуан Х. Выбор подходящего метода для идентификации точек начала репликации в микробных геномах [J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6:1049.