- Фон
Данные, обобщенные в этом отчете, предоставлены компанией Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. для MycAway.ТМ Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР в реальном времени (2G) продукт.
Сводные данные предназначены только для справки пользователя, и пользователю необходимо проверить метод микоплазмы, используя собственные образцы, чтобы подтвердить, что метод может соответствовать требованиям пользователя. Всем лабораториям, использующим этот набор, рекомендуется проверить следующие параметры: предел обнаружения, специфичность и надежность.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. может предоставить подробный отчет о квалификации для этого набора. Если пользователь использует этот отчет, то следует проверить только пригодность (включая предел обнаружения и специфичность).
Содержание проверки：
| Производительность | Параметры проверки | Результаты проверки |
| Предел обнаружения | Предел обнаружения штамма микоплазмы | Предел обнаружения для 10 типов фармакопейных микоплазм: 10 КОЕ/мл, каждый тест проводился 24 раза с показателем обнаружения ≥95%. |
| Специфичность | Образец матрица интерференции | Протестировано 9 различных матриц образцов и растворов для разбавления ДНК, микоплазма не обнаружена. |
| Перекрестная реактивность | Протестировано 14 штаммов и 6 инженерных клеток, обычно используемых в биофармацевтике, микоплазма не обнаружена. | |
| Прочность | Стабильность при замораживании-оттаивании | Выдерживает 20 повторных циклов замораживания-оттаивания без снижения эксплуатационных характеристик комплекта. |
| Устойчивость к тепловому ускорению | Не подвержен влиянию при температуре 37°C в течение 14 дней и 4°C в течение 30 дней. | |
| Совместимость с инструментами | Совместимо с ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 и Roche LightCycler®480. | |
| Покрытие | Охват типов ДНК микоплазм | Сравнение баз данных с использованием последовательностей 16S рРНК микоплазмы охватывает 183 вида класса Mollicutes. |
- Экспериментальные материалы и методы
2.1 MycAwayТМ Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР в реальном времени (2G), производитель: Yeasen, номер по каталогу: 40619ES60.
2.2 МолПурТМ Набор для подготовки образцов остаточной магнитной ДНК, производитель: Yeasen, номер по каталогу: 18461ES60.
2.3 Стандарты чувствительности микоплазмы закупаются у Minerva Biolabs (MB), штаммы которой взяты из Национальной коллекции типовых культур (NCTC). Стандарты чувствительности представляют собой инактивированную микоплазму и используются для методологической проверки метода амплификации нуклеиновых кислот (метод qPCR/PCR) для обнаружения микоплазмы. Всего закупается 10 видов микоплазм, которые включают требования EP 2.6.7 и JP G3. Информация о стандартах следующая:
| Продавец | Номер кат. | Номер NCTC | АТСС Нет. | Название материала |
| Минерва Биолабс (МБ) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма аргинини |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма оральная | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма галлисептикум | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма пневмонии | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Mycoplasma synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма ферментанс | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма гиоринис | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Acholeplasma laidlawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Спироплазма цитри | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10КОЕ™ Стандарт чувствительности Микоплазма саливариум |
2.4 Исходные данные: электронная версия была записана в «Экспериментальном отчете». подфайл родительского файла 'MycAwayТМ Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР в реальном времени (2G).
2.5 Методы: Материалы и методы работы, используемые для эксперимента, в основном были произведены или установлены компанией Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., которые оценивались и проверялись в течение длительного времени, разработка и производство наборов соответствуют системе ISO 13485.
- Содержание и результаты квалификации
3.1 Предел обнаружения (ПО)
Извлечение нуклеиновой кислоты, а также обнаружение стандартного штамма Mycoplasma 10 КОЕ/мл выполнялось в соответствии с инструкциями для стандартного штамма, а также инструкциями для набора для извлечения и обнаружения. Всего было получено 24 анализа для стандартного штамма Mycoplasma 10 КОЕ/мл. Образцы NCS (отрицательный контрольный образец) и NTC (контроль без шаблона) тестировались одновременно в каждом эксперименте.
Результаты показали, что результаты NCS и NTC были удовлетворительными, и все 24 образца 10 КОЕ/мл дали положительный результат, что соответствует требованию наличия не менее 23 положительных результатов из 24 тестов.
| Нет. | Название материала | Концентрация бактериальной жидкости |
| 1 | Микоплазма аргинини | 10 КОЕ/мл |
| 2 | Микоплазма оральная | 10 КОЕ/мл |
| 3 | Микоплазма галлисептикум | 10 КОЕ/мл |
| 4 | Микоплазма пневмонии | 10 КОЕ/мл |
| 5 | Mycoplasma synoviae | 10 КОЕ/мл |
| 6 | Микоплазма ферментанс | 10 КОЕ/мл |
| 7 | Микоплазма гиоринис | 10 КОЕ/мл |
| 8 | Ахолеплазма laidlawii | 10 КОЕ/мл |
| 9 | Спироплазма цитри | 10 КОЕ/мл |
| 10 | Микоплазма саливариум | 10 КОЕ/мл |
Таблица 1 Информация о проверенных штаммах
| 10 КОЕ/мл | Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Эксперимент 3 |
| Скорость обнаружения | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Общий | 24/24 | ||
Таблица 2 Результаты предела обнаружения
3.2 Специфичность
3.2.1 Диапазон тестов на микоплазму
Последовательности зондов праймеров в наборе были сравнены с геномом 16S рРНК в базе данных. С помощью биоинформатического анализа было получено, что MycAwayТМ Набор для обнаружения микоплазм методом ПЦР (зондовый метод) компании NextSense Biologicals может охватывать не менее 183 видов зооксантелл, включая 120 видов микоплазм, 9 видов уреаплазм, 33 вида спироплазм и 7 видов холестронгил и т. д.
3.2.2 Образец интерференции матрицы
9 субстратов (среда Дульбекко MEM, среда Хэма F-10, среда М-199, среда Хэма F-12K Kaighn's, среда RPMI-1640, среда Маккоя 5A, среда Хэма F-12K Kaighn's+1,0 мМ/л глутамина, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.0,05 мМ L-глутамина, стандартной среды DMEM с низким содержанием глюкозы) используются в качестве образцов для проверки интерференции матрицы образца, результаты показали, что среда не оказывает интерференции на реагенты набора.
3.2.3 Диапазон обнаружения Flexibacteria
Требуется извлечение и обнаружение инактивированной микоплазмы (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) в концентрации 10 КОЕ/мл, а также тестирование образцов NCS и NTC.
Результаты показали, что NCS и NTC не были обнаружены, и результаты были отрицательными; все 10 видов микоплазм были обнаружены, и результаты были положительными.
3.2.4 Перекрестная реакция
Для 14 штаммов негибких бактерий, включая Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), ряд других распространенных микроорганизмов бацилло-кокково-грибковых групп (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis и Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus), и шесть сконструированных клеток (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) были использованы для обнаружение микоплазмы с помощью MolPureТМ Метод магнитных частиц для предварительной обработки образцов остаточной ДНК (бутылки) и MycAwayТМ Набор для ПЦР-детекции микоплазмы (зондовый метод) (2G), и каждый эксперимент проводился одновременно с тестированием образцов PCS, NCS и NTC.
Результаты показали, что результаты PCS, NCS и NTC были удовлетворительными; тестовые образцы были отрицательными, и перекрестной реактивности не наблюдалось.
3.3 Надежность
3.3.1 Стабильность при замораживании-оттаивании
Тестовый набор для выявления микоплазмы был подвергнут экспериментам по замораживанию-оттаиванию при температуре от -25℃ до -15℃, и результаты показали, что набор способен выдерживать 20-кратное повторное замораживание и оттаивание, при этом его характеристики не пострадали.
3.3.2 Ускоренная стабильность
Набор для обнаружения микоплазмы подвергался термической обработке при температуре 37 ℃ в течение 14 дней и при температуре 4 ℃ в течение 30 дней соответственно. Результаты показали, что эффективность продукта не пострадала.
3.3.3 Применимость инструмента
Для набора для обнаружения микоплазмы в качестве образцов для тестирования использовались различные концентрации положительного контроля и ДНК Mycoplasma pneumoniae в наборе, а эксперименты проводились на четырех различных марках и моделях, а именно: Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S и Roche LightCycler®480 соответственно.Эксперименты проводились на приборах для количественной ПЦР четырех различных марок и моделей: Shanghai Hongshi SLAN-96S и Roche LightCycler®480.
Результаты показали, что образцы, подлежащие тестированию, были обнаружены на приборах для ПЦР различных моделей производителей, отрицательные результаты контроля были квалифицированы, а производительность набора не была затронута.
- 4.Ссылка
4.1 Метод исследования микоплазмы <3301>. Китайская фармакопея, часть III [S]. Пекин: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Руководство по валидации аналитических методов <9101>. Китайская фармакопея, часть III [S]. Пекин: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Руководство по валидации альтернативных методов микробиологического тестирования фармацевтических препаратов <9201>. Китайская фармакопея, часть III [S]. Пекин: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Микоплазмы. Европейская фармакопея[S]. 10-е издание, 2020: Раздел 2.6.7, 194-199.
4.5 Тестирование клеточных субстратов, используемых для производства биотехнологических/биологических продуктов, на наличие микоплазм <G3-14-170>. Японская фармакопея[S]. 18-е издание, 2021: 2678-2682.
4.6 Эрика Дж. Фратц-Берилла, Филипп Ангарт, Райан Дж. Грэм и др. Влияние моноклональных антител, полученных в культурах биореакторов клеток CHO, на показатели качества продукции во время преднамеренного заражения микоплазмой. Биотехнология и биоинженерия. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Дмитрий В. Волохов, Лори Дж. Грэм, Курт А. Брорсон, Владимир Е. Чижиков. Тестирование клеточных субстратов и биопрепаратов на микоплазму: обзор альтернативных немикробиологических методов. Mol Cell Probes. 2011 Апрель-июнь;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Метод обнаружения ПЦР для проверки загрязнения микоплазмой ветеринарных вакцин и биологических продуктов. Lett in Applied Microbiology. 2015 февраль;60(2):174-180.
Информация о заказе
| Описание | Номер детали |
| Набор для подготовки образцов остаточной магнитной ДНК MolPure® | 18461ES |
| Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР MycAway™ (2G) | 40619ES |