Обзор
Остаточная ДНК клетки-хозяина — это связанная с процессом примесь, которая участвует в производстве биопрепаратов и которая не только снижает эффективность биопрепаратов, но и может представлять угрозу безопасности, например, инфекционность или онкогенность. Поэтому регулирующие органы в разных странах ввели ограничения на количество остаточной ДНК в биопрепаратах.
Текущие рекомендации ВОЗ и FDA рекомендуют остаточную ДНК в готовых продуктах не более 10 нг/дозу, а FDA также заявляет, что остаточная ДНК в ДНК клеток-хозяев биологических препаратов не должна превышать 100 пг/дозу. Общие принципы Европейской фармакопеи предусматривают, что большинство пределов остаточной ДНК биологических продуктов должны составлять не более 10 нг/дозу, но пределы остаточной ДНК отдельных вакцин более строгие, например, остаточная ДНК в инактивированной вакцине против гепатита А не должна превышать 100 пг/дозу, а остаточная ДНК в вакцине против гепатита В не должна превышать 10 пг/дозу. В издании Китайской фармакопеи 2020 года, часть III, указано, что остаток ДНК в биологических препаратах, произведенных на клеточном матриксе, не должен превышать 100 пг/дозу, а остаток ДНК в вакцинах, произведенных на бактериальном или грибковом матриксе, не должен превышать 10 нг/дозу.
Кроме того, для методов определения остатков экзогенной ДНК национальные фармакопеи также дают руководящие рекомендации. В издании USP40-NF35 Общего положения 1130 Фармакопеи США 2017 года описываются 3 метода определения остатков экзогенной ДНК, которые являются гибридизацией ДНК-зонда, пороговым методом и методом количественной ПЦР в реальном времени. Европейская фармакопея предлагает количественные ПЦР в реальном времени и иммуноферментные методы, которые являются 2 чувствительными аналитическими методами количественной оценки остаточной ДНК в клетках-хозяевах. Версия трех общих правил 3407 Китайской фармакопеи 2020 года также предусматривает, что методами обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах являются гибридизация ДНК-зонда, флуоресцентное окрашивание и количественная ПЦР.
Среди них метод количественной ПЦР обладает очень высокой чувствительностью, специфичностью последовательности и точностью, что может стать надежным средством обнаружения для биофармацевтической промышленности при исследовании технологических процессов и контроле качества готовой продукции, и в настоящее время стал предпочтительным методом обнаружения для каждого производителя биологической продукции.
Биотехнологии Йесена Наборы для обнаружения остаточной ДНК
Основываясь на принципе флуоресцентного зонда qPCR, Yeasen разработала серию быстрых и специализированных наборов для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах, включая CHO, HEK293, E.coli, Vero, Human, MDCK, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris и т. д. Эти наборы обеспечивают специализированное и быстрое обнаружение остатков ДНК в промежуточных, полуфабрикатных и готовых продуктах в процессе разработки и производства биологических препаратов, таких как препараты на основе антител, продукты клеточной и генной терапии, рекомбинантные белковые препараты и вакцины.
Особенность
Высокая чувствительность: Разработан на основе метода ПЦР с флуоресцентным зондом с низким пределом обнаружения (НПД) до 0.05фг/мкл;
Высокая точность: Извлечение образцов в диапазоне 70%~130%;
Высокая специфичность: отсутствие перекрестной реакции с нерелевантной ДНК, что снижает количество ложноположительных результатов при обнаружении;
Соблюдение правил: полностью проверено в соответствии с Chp, USP, ICHQ2(R1) и другими требованиями, эксплуатационные характеристики соответствуют китайским и зарубежным нормативным стандартам;
Сотрудничать с аудитом: Производство продукции соответствует стандартам системы качества ISO13485, что подтверждается безупречными документами аудита.
Гарантия качества: Все исходные материалы для наборов разрабатываются независимо, а смесь для ПЦР и другие ферментные продукты производятся на сверхчистой фабрике ферментов.
Приложение
Антитела ПрепаратыОбнаружение остаточных примесей в клетках-хозяевахВакциныОбнаружение остаточных примесей в клетках-хозяевах
Рекомбинантные белковые препаратыОбнаружение остаточных примесей в клетках-хозяевах
Спецификация
| Программа тестирования и проверки | Справочные стандарты или требования | Нотметка | |
| 1. Стандарты комплекта (эталонные стандарты) | Сопоставление с национальными стандартами или Подготовленные стандарты |
| |
| 2. Ллинейный Ранге | Область действия стандартной кривой | Обратитесь к руководству или фактической ситуации. (например, 30фг/мкл~300пг/мкл) |
|
| Р2 | ≥0,98 (PsYeasen Kits≥0.99) | Требования к HCD в Китайской фармакопее 2020 г., издание 3407, общие положения | |
| Склон | -3,1~-3,8 (Комплекты PsYeasen -3.1~-3.6) | Требования к HCD в Китайской фармакопее 2020 г., издание 3407, общие положения | |
| Эффективность усиления | 90%~110%（（PsСоответствующий наклон -3.1~-3.6, Требования внутри отрасли) |
| |
| 3. Аточность | Отклонение от национального стандарта ДНК | ＜15% |
|
| Скорость восстановления образца при добавлении | 50%~150% (требования внутри отрасли) 70~130%） | Требования к HCD в Китайской фармакопее 2020 г., издание 3407, общие положения | |
| 4. Пточность | Повторяемый | Коэффициент вариации＜15% |
|
| Средняя точность | Коэффициент вариации＜15% |
| |
| 5. Сспециальность | Отсутствие помех со стороны экзогенной ДНК |
| |
| 6. Лпредел количественной оценки | уровень фг/мкл |
| |
| 7. Стабликость | Повторное замораживание и оттаивание | 10 раз |
|
| Стабильность ускорения | 2~8℃ 30 дней, 37℃ 14 дней |
| |
| Срок действия | -20°C хранение в течение 2 лет |
| |
Цифры
Высокая чувствительность: LLOQ всего 0,3 фг/мкл, LLOD всего 0,05 фг/мкл.
1. Линейный диапазон набора для определения остаточной ДНК клеток-хозяев CHO (3G) составил 3фг/мкл~300пг/мкл, R2=1, эффективность амплификации составила 99,29%, а CV значения обнаружения каждой концентрации составил <15%.
Рисунок 1. Калибровочный график ДНК CHO (3G) (слева) и линейное картирование кривой амплификации (справа)
2.Определите ДНК CHO (3G) в самой низкой точке концентрации стандартизированной песни при концентрациях 3fg/uL и ниже, 10 повторов на концентрацию. Результаты показали, что при концентрациях 0,3 fg/uL и выше CV был <20%, т.е. предел количественного определения набора для анализа остатков ДНК клеток-хозяев CHO (3G) составил 0,3 fg/uL.
Рисунок 3. Результаты анализа 0,05 фг/мкл ДНК CHO (3G) методом ПЦР
Высокая специфичность: отсутствие перекрестной реакции с ДНК других клеток-хозяев.
При оценке интерференции геномной ДНК видов мышей с высоким сродством к ДНК CHO (3G), а также геномной ДНК клеток, обычно используемых в производстве биологических препаратов, с реагентом для обнаружения ДНК CHO, кривые амплификации группы интерференции и контрольной группы перекрывались, и никакой интерференции не наблюдалось (на следующих графиках по порядку показаны данные интерференции геномной ДНК мыши, HEK293 и E.coli с реагентом для обнаружения ДНК CHO).
Рис. 4.Результаты экспериментов по интерференции с набором ДНК CHO (3G)
Информация о продукте
| Категоризация | Номер товара | Название продукта | Спецификация |
| Предварительная обработка образца | 18461ES | Набор для подготовки образцов остаточной магнитной ДНК MolPure® | 25Т/100Т |
| 18467ES | Комплект для подготовки образцов MolPure® Mag48 FN | 3×16Т/6×16Т | |
| Инструмент для извлечения нуклеиновых кислот | 80511ES | 48-канальный автоматический экстрактор нуклеиновых кислот | 48 флюсов |
| Обнаружение остаточной ДНК | 41307ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах Vero (2G) | 50Т/100Т |
| 41308ES | Набор для обнаружения остатков ДНК клетки-хозяина E.coli (2G) | 50Т/100Т | |
| 41310ES | Набор для обнаружения остатков ДНК SV40LTA&E1A | 50Т/100Т | |
| 41317ES | Набор для обнаружения остатков ДНК клетки-хозяина Hansenula polymorpha | 50Т/100Т | |
| 41319ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах MDCK | 50Т/100Т | |
| 41323ES | Набор для обнаружения остатков плазмидной ДНК | 50Т/100Т | |
| 41324ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах S. cerevisiae | 50Т/100Т | |
| 41325ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах человека | 50Т/100Т | |
| 41328ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах Pichia pastoris | 50Т/100Т | |
| 41330ES | Набор для обнаружения остатков ДНК Sf9 и бакуловируса | 50Т/100Т | |
| 41331ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах HEK293 (3G) | 50Т/100Т | |
| 41332ES | Набор для обнаружения остатков ДНК в клетках-хозяевах CHO (3G) | 50Т/100Т |