Технология изотермической амплификации позволяет достичь цели амплификации определенных последовательностей нуклеиновых кислот в условиях постоянной температуры. Благодаря характеристикам отсутствия специального оборудования, короткого времени амплификации и высокой чувствительности она показала хорошие перспективы применения в обнаружении на месте и диагностике в месте оказания помощи и очень подходит для разработки инструментов молекулярной диагностики.

В контексте пандемии нового коронавируса с ростом штаммов и инфекционности технология изотермической амплификации может обнаружить новый коронавирус быстро с помощью простых инструментов, помогая решить проблему, связанную с тем, что у некоторых пациентов с COVID-19 невозможно быстро подтвердить диагноз из-за длительного времени обнаружения и высоких требований к оборудованию для обнаружения и реагентам традиционных методов ПЦР. Так в чем же заключается принцип RT-LAMP, одного из методов изотермической амплификации? Какое высококачественное сырье может предоставить Yeasen?

1. В чем принцип работы RT-LAMP?
2. Проектирование праймера для RT-LAMP
3. Какое сырье может предоставить Yeasen?
4. Руководство по выбору продукции

1. В чем принцип работы RT-LAMP?

В 2000 году японские ученые Нотоми и другие создали новую технологию амплификации нуклеиновых кислот, называемую петлевой изотермической амплификацией (LAMP). LAMP использует 4 специфических праймера, разработанных для 6 областей целевого гена, и использует ДНК-полимеразу с замещением цепи для амплификации 109 копий целевой последовательности за десятки минут в изотермических условиях (60～65 ℃). Результаты оценивались с помощью электрофореза в агарозном геле, и положительные результаты показали полосы в форме лестницы. LAMP обладает характеристиками сильной специфичности, высокой чувствительности, быстрой и простой работы и низкой стоимости. Благодаря постоянному улучшению и совершенствованию этой технологии она в настоящее время используется для обнаружения различных патогенных микроорганизмов.

RT-LAMP — это метод, в котором обратная транскриптаза добавляется в систему амплификации LAMP, что позволяет реализовать прямое обнаружение вирусной РНК. Эффективность амплификации LAMP чрезвычайно высока, поэтому большое количество нуклеиновой кислоты может быть амплифицировано с использованием лишь небольшого количества кДНК. Время обратной транскрипции в процессе амплификации нуклеиновой кислоты экономится, а скорость обнаружения РНК ускоряется.

ДНК находится в состоянии динамического равновесия при температуре около 65℃. Под действием ДНК-полимеразы смещения цепи, начиная с 3'-конца сегмента F2 праймера FIP, она спаривается с комплементарной последовательностью шаблонной ДНК для инициирования синтеза ДНК со смещением цепи. Праймер F3 комплементарен F3c на переднем конце F2c и берет 3'-конец в качестве отправной точки для синтеза своей ДНК, заменяя цепь ДНК, синтезированную ведущим праймером FIP, под действием ДНК-полимеразы смещения цепи. Продлевается вперед. Цепь ДНК, синтезированная конечным праймером F3, образует двойную цепь с одной цепью ДНК-матрицы. Цепь ДНК, синтезированная праймером FIP, заменяется цепью праймера F3 для создания одной цепи. Эта одиночная цепь имеет комплементарные сегменты F1c и F1 на 5'-конце, поэтому выполняется самоспаривание оснований для формирования кольцевой структуры. Праймер BIP гибридизуется и объединяется с одиночной цепью, а 3'-конец праймера BIP используется в качестве отправной точки для синтеза комплементарной цепи, и в ходе этого процесса структура раскрывается.Затем из праймера BIP вставляются праймеры, похожие на F3 и B3, выполняется комплементарное спаривание оснований, и новая комплементарная цепь синтезируется с 3'-конца в качестве отправной точки. На обоих концах замененной одноцепочечной ДНК имеются комплементарные последовательности, и происходит самоспаривание оснований с образованием кольцевой структуры, поэтому вся цепь представляет собой гантелеобразную структуру. Эта структура является стартовой структурой цикла амплификации метода RT-LAMP.

В гантелевидной структуре удлинение ДНК осуществляется с использованием сегмента F1 на 3'-конце в качестве отправной точки и самого себя в качестве шаблона. А праймер FIP F2 гибридизуется с одноцепочечным F2c на петле, чтобы инициировать новый раунд реакции смещения цепи. Двухцепочечная нуклеиновая кислота, синтезированная из сегмента F1, диссоциирует, и аналогичным образом на нуклеиновой кислоте образуется кольцевая структура. На кольцевой структуре имеется одноцепочечная форма B2c, и B2 на праймере BIP гибридизуется с ней, чтобы инициировать новый раунд амплификации, и кольцевая структура образуется в результате того же процесса. Согласно этому процессу, комплементарные последовательности на одной и той же цепи проходят цикл спаривания, удлинения цепи и, наконец, образуют структуры разных размеров.

2. Проектирование праймера для RT-LAMP

Дизайн праймера является ключом к успешной амплификации и обнаружению RT-LAMP. Праймеры RT-LAMP включают два внешних праймера (F3 и B3) и два внутренних праймера (FIP и BIP). Праймер F3: верхний внешний праймер, состоящий из области F3, комплементарен области F3c целевого гена. Праймер FIP: верхний внутренний праймер, состоящий из области F2, область F2c на 3'-конце целевого гена в области F2 комплементарен области F1c на 5'-конце целевого гена. Праймер BIP: нижний внутренний праймер, состоящий из области B2, область B2 комплементарен области B2c на 3'-конце целевого гена и имеет ту же последовательность, что и область B1c на 5'-конце целевого гена.

Подобно ПЦР, принципы проектирования праймеров должны учитывать такие факторы, как состав оснований, содержание GC и субструктура. Кроме того, следует отметить следующие моменты. 5'-концевые части внутренних праймеров FIP и BIP, т. е. F1c и B1c, обычно имеют длину 8-50 п. н. Предпочтительно, чтобы длина составляла 15-25 п. н., а значение Tm больше, чем значения Tm F2 и B2 в 3'-концевой части. 3'-концевые части внутренних праймеров FIP и BIP, т. е. F2 и B2, обычно имеют длину 8-50 п. н. Предпочтительно, чтобы длина составляла 15-25 п. н., а значение Tm согласуется с оптимальной температурой ДНК-полимеразы Bst, выбранной в эксперименте. Длины внешних праймеров F3 и B3 обычно составляют 8-50 п. н. Длина предпочтительно составляет 15-25 п.н., а ее значение Tm меньше, чем у F2 и B2. При проектировании праймеров следует учитывать структуру петли и размер целевой последовательности. Когда количество оснований в петле больше 40 п.н., а размер целевой последовательности составляет 130-200 п.н., эффективность амплификации самая высокая.

3. Какое сырье может предоставить Yeasen?

3.1 [Новое обновление] Йесен Бст Плюс ДНК-полимераза

Недавно модернизированный ДНК-полимераза Hieff™ Bst Plus (Кат.№ 14402ES, 14403ES) получен путем экспрессии и очистки гена ДНК-полимеразы Bacillus stearothermophilus зр отсутствие 5′→3′ экзонуклеазного домена в E.coli.Способность фермента к замещению цепи сильна и имеет такие преимущества, как высокая чувствительность, высокая эффективность амплификации и высокая толерантность к dUTP, и может широко использоваться для обнаружения патогенов в реальном времени на основе технологии изотермической амплификации.

3.1.1 Быстрота и высокая чувствительность

ДНК-полимераза Yeasen Hieff™ Bst Plus обладает высокой чувствительностью и может обнаружить целевой ген всего в 5 копиях. Количество шаблона находится на уровне фемтограмма (fg), а скорость амплификации выше, чем у конкурирующих продуктов.

Рисунок 1. Реакция RT-LAMP проводилась с использованием Йезена. ДНК-полимераза Hieff™ Bst Plus (оранжевый) и ферменты Bst конкурента N (серый) и конкурента T (синий) для амплификации SARS-CoV-2. Результаты показывают, что ДНК-полимераза Yeasen Hieff™ Bst Plus всегда может достичь порога быстрее, чем конкурирующие продукты, а скорость амплификации выше.

4. Руководство по выбору продукции

Компания Yeasen предлагает следующую продукцию:

Таблица 1.Информация о продукте