Двойное анти-так ДНК-полимеразное антитело, чтобы помочь снизить неспецифическое усиление

Молекулярная диагностика является наиболее быстро развивающейся подобластью в области IVD. Она имеет преимущества короткого времени обнаружения, высокой чувствительности и сильной специфичности. Она широко используется в диагностике сопутствующих опухолей и скрининге инфекционных заболеваний и генетических заболеваний. В области молекулярной диагностики ПЦР является не только наиболее зрелой технологической платформой с самой большой долей рынка, но и «золотым стандартом» технологии клинической диагностики. В традиционной реакции ПЦР часто возникает проблема неспецифической амплификации. Неспецифическая амплификация напрямую влияет на интерпретацию результатов обнаружения и приведет к снижению чувствительности амплификации и даже выходу целевых фрагментов. Как происходит неспецифическая амплификация и как ее можно эффективно избежать?

1. Обычная ДНК-полимераза может привести к неспецифической амплификации

2. Полимераза горячего старта может улучшить специфичность амплификации

3. Двойное блокирующее антитело Taq может в два раза улучшить специфичность и стабильность амплификации

4. Демонстрация производительности Double-Block Taq от Yeasen антитело

5. Информация о продукте

1. Обычная ДНК-полимераза может привести к неспецифической амплификации

Низкая специфичность последовательности праймеров является прямой причиной неспецифической амплификации. Как промоутер обычной ДНК-полимеразы, его экзонуклеазная активность может укоротить последовательность ДНК-праймера во время подготовки системы ПЦР, чтобы снизить специфичность праймеров.

Кроме того, обычная ДНК-полимераза обладает не только экзонуклеазной активностью, но и полимеразной активностью. Хотя оптимальная температура удлинения ДНК-полимеразы составляет 72℃, полимераза остается активной при комнатной температуре. Поэтому во время подготовки реакции ПЦР и начального процесса нагрева праймеры могут образовывать неспецифическое связывание с некоторыми одноцепочечными матрицами и удлиняться под действием ДНК-полимеразы Taq, что приводит к амплификации нецелевых последовательностей и влияет на специфичность реакции.

Поэтому системы ПЦР часто конфигурируются на льду для ингибирования активности ДНК-полимеразы. Хотя этот метод прост и дешев, он не может полностью ингибировать активность фермента, поэтому он не может исключить амплификацию неспецифических продуктов.

2. Полимераза горячего старта может улучшить специфичность амплификации

Полимераза горячего старта является основным компонентом ПЦР горячего старта. При комнатной температуре активный сайт ДНК-полимеразы блокируется модификатором фермента. Только после денатурации ПЦР при 95℃ модификатор фермента отпадает и начинается активность фермента, что позволяет избежать неспецифической амплификации, вызванной ферментом.

В настоящее время на рынке широко используются методы модификации ДНК-полимеразы с горячим стартом, в основном, химический метод, метод лиганда и метод антител. Среди них блокирующий эффект полимеразы с горячим стартом, модифицированной антителами, является наилучшим, а скорость высвобождения активности фермента высока, что может значительно сократить время реакции ПЦР. Это метод модификации фермента с горячим стартом, широко используемый на рынке IVD.

Однако следует отметить, что традиционный метод горячего старта антител блокирует только 5'→3'-полимеразную активность ДНК-полимеразы Taq, что может предотвратить только неспецифическую амплификацию, вызванную несоответствием или димеризацией праймера при низких температурах.Однако, как упоминалось выше, Taq ДНК-полимераза обладает не только 5'→3' полимеразной активностью, но и 5'→ 3' экзонуклеазной активностью. Эта экзонуклеазная активность может приводить к деградации несовпадающих зондов или других материалов при низких температурах, что приводит к появлению некоторых неспецифических сигналов.

3. Двойное блокирующее антитело Taq может в два раза улучшить специфичность и стабильность амплификации

Будучи инновационным лидером в отечественной молекулярной ферментной промышленности, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (далее именуемая Yeasen) фокусируется на НИОКР и производстве молекулярного ферментного сырья и осмеливается на инновации. Опираясь на собственную зрелую платформу скрининга антител, она проводит скрининг блокирующего антитела с Taq ДНК-полимеразой в качестве целевой молекулы. После многих лет кропотливых исследований и оптимизации системы она разработала антитело двойного блока против ДНК-полимеразы Taq, Он может не только блокировать полимеразную активность ДНК-полимеразы Taq, но и блокировать экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq. В двухстороннем подходе он может не только эффективно предотвращать неспецифическую амплификацию, вызванную несоответствием или димером праймера, но и предотвращать деградацию материала, генерирующую неспецифические сигналы, и вдвойне улучшать стабильность реагента.

4. Демонстрация производительности Double-Block Taq от Yeasen антитело

4.1 Использование антител Taq с двойным блоком является точным и более чувствительным

После блокирования Taq-полимеразы двойным блокирующим антителом Йезена и антитела компании T, положительные образцы были обнаружены методом ARMS-ПЦР.

Рисунок 1. Кривая амплификации ARMS-ПЦР; Синий: блокирующее антитело компании T; Красный: антитело Йесена с двойным блоком

Из рисунка 1 видно, что полимераза Taq, заблокированная двойным блокирующим антителом Йезена, имеет точное типирование и более высокую чувствительность в амплификации ARMS-ПЦР.

4.2 Эффективность антитела Taq с двойным блоком Блокирует экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq

Синтезированные праймерные зонды сопоставляли с реакционным раствором ДНК-полимеразы Taq, заблокированной незакрытыми и дважды заблокированными антителами соответственно, и реагировали при 40℃ для обнаружения их флуоресцентных сигналов.

Рисунок 2. Определение эффективности блокирования двойного блокирующего антитела для экзонуклеазной активности; Желтый: незакрытая группа ДНК-полимеразы Taq; Фиолетовый: группа ДНК-полимеразы Taq заблокирована двойным блокирующим антителом.

Это видно из рисунка 2. что антитело с двойным блоком может эффективно блокировать экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq.

4.3 Двойное блокирующее антитело Taq может эффективно улучшить стабильность реагента для обнаружения

Taq ДНК-полимераза была заблокирована традиционным блокирующим антителом и двойным блокирующим антителом соответственно и сконфигурирована в полный премикс, содержащий праймерный зонд. 10000 копий плазмиды ASF были амплифицированы при 4℃ в течение 10 дней или при 37℃ в течение 1, 3 и 5 дней. Наблюдались изменения кривой амплификации и значения Ct, а также сравнивались эффекты традиционного блокирующего антитела и двойного блокирующего антитела на стабильность полного реакционного раствора премикса.

Рисунок 3.Кривая амплификации 10000 копий плазмиды АЧС, амплифицированной традиционным блокирующим антителом (а) и блокирующим реакционным раствором с двойным блокирующим антителом (б); Синий: хранить при температуре 4℃ в течение 10 дней; Красный: помещён при температуре 4℃ на 0 дней (контроль)

Из рисунка 3 видно, что антитело с двойным блоком может поддерживать стабильность реакционного раствора и эффективно улучшать стабильность реагента обнаружения, чем традиционное блокирующее антитело. Кривая амплификации и значение Ct существенно не изменились после того, как весь премикс, содержащий праймерный зонд, был заблокирован антителом с двойным блоком и помещен при температуре 4℃ на 10 дней.

Рисунок 4. Кривая амплификации 10000 копий плазмиды АЧС, амплифицированной традиционным блокирующим антителом (а) и двойным блокирующим антителом (б) в растворе для блокирования реакции; Синий: хранить при температуре 37℃ в течение 5 дней; Зеленый: 37℃ в течение 3 дней; Желтый: 37℃ в течение 1 дня; Красный: помещён при температуре 37℃ на 0 дней (контроль)

Из рисунка 4 видно, что антитело с двойным блоком может поддерживать стабильность реакционного раствора и эффективно улучшать стабильность реагента обнаружения, чем традиционное блокирующее антитело. Антитело с двойным блоком блокирует всю предварительную смесь, содержащую праймер-зонд, и разница в значении Ct составляет менее 0,2 после помещения при 37℃ в течение 1, 3 и 5 дней.

4.4. Двойное блокирование антител Taq помогает решить проблему дрейфа базовой линии

Когда некоторые праймеры взаимодействуют с определенным буфером и инструментами, будет дрейф базовой линии. Йесен перепробовал много методов для улучшения проблемы базовой линии и обнаружил, что антитело с двойным блоком более благоприятствует стабильной базовой линии.

Рисунок 5. Кривая амплификации гена N (а) и гена ACT (б); Красный: традиционное блокирующее антитело; Зеленый: антитело двойного блока

Как видно из рисунка 5, использование двойных блокирующих антител под специфическими праймерами и буферами может помочь решить проблему дрейфа базовой линии.

4.5 Хорошая линейность была получена с использованием двойного блока антител Taq

100000, 10000, 1000 и 100 копий двойных плазмид ASF/ACT были амплифицированы с реакционным раствором, заблокированным двойным блокирующим антителом, и была построена стандартная кривая.

Рисунок 6. Стандартные кривые гена ASF (a) и гена ACT (b), полученные с помощью двухблочной реакции раствора

Как видно из рисунка 6, стандартная кривая R2 гена АЧС составляет 0,998, а эффективность амплификации составляет 98,848%; Стандартная кривая R2 гена ACT составила 0,998, а эффективность амплификации — 98,113%.

4.6 Двойной блок Taq Антитело может быстро высвобождать ферментную активность

Taq-полимераза была заблокирована импортированным антителом компании T и Двойное блокирующее антитело Йесена (кат. № 31303) соответственно, и активность фермента была обнаружена после теплового шока при 95 ℃ в течение 20 с. Видно, что 31303 может высвобождать более 95% активности фермента после теплового шока при 95 ℃ в течение 20 с, что эквивалентно антителу компании T.

Таблица 1. Активность ферментов

4.7 Двойной блок Taq Антитело Может блокировать многие типы ферментов Taq

Три типа ферментов Taq (дикий тип и 2 мутанта) были заблокированы двойным блокирующим антителом Йесена (кат. № 31303), а блокирующее отношение составило 1 мкг: 5 U, измеряя значение флуоресценции и эффективность запечатывания. Видно, что блокирующий эффект двойного блокирующего антитела Йесена (кат. № 31303) лучше для разных типов ферментов Taq.

Таблица 2. Эффективность блокирования различных типов ферментов Taq

4.8 Йесен Антитело Taq с двойным блоком не имело геномного остатка у мышей

Взяв воду в качестве шаблона для отрицательного контроля и геном мыши в качестве шаблона для положительного контроля, 31303 различных партий были амплифицированы. Было обнаружено, что целевой фрагмент не был амплифицирован в образце, что указывает на отсутствие остатка генома мыши в антителе.

Рисунок 7. Диаграмма обнаружения остатков генома мыши

Примечание: - — отрицательный контроль, + — положительный контроль, а 1–5 — 31303 образца разных партий.

5. Информация о продукте