По мере развития медицинских исследований целевая терапия становится все более зрелой. Предпосылкой целевого лечения является проведение генетического тестирования молекулярных мишеней лекарств для выявления мутаций генов, вызывающих наследственные заболевания или злокачественные новообразования. ARMS-PCR — это новый метод, основанный на ПЦР, который может обнаруживать многочисленные точечные мутации ДНК. В настоящее время это один из самых важных и распространенных методов для индивидуальной генетической идентификации раковых заболеваний. Преимущества его терапевтического использования были хорошо признаны экспертами в этой области.

1. Как работает аллель-специфическая ПЦР?
2. Как улучшить специфичность ARMS?
3. Каковы особенности продукции Yeasen?
4. Что такое данные о производительности продукта?
5. Как люди заказывают товары?

1. Как работает аллель-специфическая ПЦР?

ARMS-PCR — это Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), также известная как Allele-Specific PCR (AS-PCR). Аллель-специфическое расширение регулируется для идентификации аллеля дикого типа и мутантного гена дикого типа, а значение сигнала флуоресценции измеряется с помощью техники зонда Taqman.
Праймеры ARMS PCR разработаны с различными нуклеотидами на 3'-конце двух восходящих праймеров аллеля, и два праймера, соответственно, специфичны для дикого типа и мутантного типа. Во время амплификации восходящие праймеры, которые не полностью соответствуют шаблону, не способны образовывать комплементарные пары оснований, что приводит к несовпадениям, затрудненному расширению и невозможности генерировать продукты ПЦР, тогда как системы праймеров, которые соответствуют шаблону, могут амплифицировать соответствующие продукты ПЦР. Флуорофор на зонде Taqman может испускать флуоресцентный сигнал, который может быть обнаружен устройством, и генотип может быть подтвержден путем оценки данных флуоресценции.
Технология ARMS имеет высокую чувствительность, предел обнаружения может достигать 100 копий/мл, а предел обнаружения для опухолевой ткани может достигать 0,5% частоты мутаций. Кроме того, ARMS требует много времени и дешев, а результаты интуитивно понятны и просты для оценки. Это связано с тем, что ARMS в сочетании с технологией qPCR или электрофореза требует только одной реакции ПЦР, что занимает меньше времени. Для технологии ARMS необходимо оптимизировать только восходящие праймеры, которая имеет более низкую стоимость и интуитивно понятные результаты по сравнению с технологией ПЦР в реальном времени с использованием зондов MGB. Поскольку большая часть ДНК, извлеченной из образцов тканей, залитых парафином, фрагментирована, точные результаты обнаружения получить невозможно. Метод ARMS разработан для минимизации длины целевого продукта, тем самым решая эту проблему в тканях, залитых парафином. В то же время ARMS в сочетании с платформой ПЦР реализует работу в закрытой пробирке, которая проста в эксплуатации и не требует последующей обработки продукта, что позволяет в максимальной степени избежать загрязнения продуктов амплификации.
Теоретически, ДНК-полимераза Taq должна быть полностью комплементарна оставшемуся шаблону на 3'-конце праймера для проведения эффективной полимеризации. Однако на строгость ДНК Taq влияют несколько факторов. В некоторых случаях удлинение может происходить, даже если 3'-концевое основание праймера не комплементарно шаблону. Если на 3'-конце есть только одно несовпадение оснований, праймеры могут быть несовпаденными и удлиненными, но эффективность удлинения низкая. Различные дислокации 3'-конца имеют различную эффективность удлинения. Если на 3'-конце вводятся другие несовпадающие основания, количество несовпадений слишком велико, и 3'-конец не может быть удлинен после определенного уровня.Таким образом, несовпадение только одного основания на 3'-конце праймера не позволяет адекватно различить два аллеля, что приводит к ложноположительным результатам.

2. Как улучшить специфичность ARMS?

Целью улучшения специфичности ARMS является улучшение специфичности удлинения праймера. Несовпадающие основания могут быть введены во 2-е или 3-е основание от 3'-конца. Несовпадающие основания действуют вместе с несовпадающими основаниями на 3'-конце, и в матрице, которая не комплементарна 3'-концу, скорость амплификации продукта праймера снижается. В то время как праймеры обычно амплифицируются в матрицах, комплементарных их 3'-концам, тип несовпадающих оснований праймеров зависит от типа несовпадения оснований на 3'-конце.
После разработки специфических праймеров для ARMS требуется пара зондов TaqMan для аллель-специфического переноса энергии флуоресцентного резонанса. Зонды TaqMan имеют два флуоресцентных красителя, 5'-конец представляет собой флуоресцентный ген, а 3'-конец имеет общий ген гашения флуоресценции. В полном зонде ген гасителя и флуорогенный ген пространственно очень близки друг к другу, что приводит к тушению флуоресценции. При нормальных обстоятельствах флуоресценция, испускаемая флуорофором на 5'-конце, не может быть обнаружена, и может быть обнаружена только фоновая флуоресценция гасителя на 3'-конце. В процессе амплификации целевого гена как праймеры ПЦР, так и флуоресцентно меченые зонды будут комплементарны целевой последовательности во время de-OR. Когда фермент Taq сталкивается с зондом, стабильно связанным с шаблоном при удлинении цепи шаблона, 5'-3' экзонуклеаза фермента Taq будет разрушать специфический зонд, связанный с шаблоном. Флуорофор на зонде отделяется физическим пространством, эффект гашения исчезает, и флуоресценция испускается. Несоответствия между слабо флуоресцентными зондами и целевыми последовательностями уменьшат количество испускаемой флуоресценции.

Рисунок 1. Основная концепция ARMS-PCR

3. Каковы особенности продукции Yeasen?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix — это набор, основанный на концепции амплифицирующих блоков, который позволяет проводить эффективное генотипирование с помощью ARMS-ПЦР.

👍Высокая селективность: возможность идентифицировать несколько генных мутаций.
👍Высокая чувствительность: мутантные праймеры могут обнаруживать мутации при концентрациях всего 0,5% в 10 нг/л ДНК;
👍Легко читать: результаты очевидны и объективно оценено, и это прост и не сложен;
👍Простота эксплуатации: прибор совместим с целым рядом оборудования для ПЦР, режим работы стандартизирован, а обнаружение на борту может быть выполнено за 90 минут.

4. Что такое данные о производительности продукта?

4.1 Превосходное воздействие блокировки продукта

Эксперимент: 5 л исходного шаблона, 10 нг/л шаблона дикого типа и эквивалентные количества мутантной плазмиды были амплифицированы с использованием мутантных праймеров.
Сайт: KRASG13D (38G>A)
Красный: 13755; Синий: Конкуренты

Рисунок 2 демонстрирует, что праймеры дикого типа амплифицируют как дикие, так и мутантные шаблоны. Согласно кривой амплификации, дикий тип шаблона не имеет пика или разница в значении Ct между диким типом и мутантом составляет 6-8, что позволяет эффективно различать дикие и мутантные гены.

4.2 Коэффициент обнаружения продукта может достигать 0,05%.

Эксперимент 1: Стандартная методика приготовления с самосмешиванием (50%): 50 мкл 10 нг/мкл ДНК дикого типа и 50 мкл 3X103 копий мутантной плазмиды.
Сайт: KRASG13D(38G>A)

Рисунок 3. Согласно кривой амплификации, продукт продолжает эффективно действовать при концентрации 0,05%.

Эксперимент 2: Приобретенный 5% стандарт (50 нг/мкл) был разбавлен разбавителем библиотеки до 10 нг/мкл, затем дополнительно разбавлен 10 нг/мкл 293 г ДНК до 0,1% и 0,05%.
Сайт: L858R
Красный: 13755; Синий: Конкуренты

Рисунок 4: Согласно кривой амплификации, частота обнаружения локусов на фоне геномной ДНК дикого типа 10 нг/мкл может достигать 0,05%, а последующая проверка по коммерческим стандартам показывает, что наши продукты имеют превосходную частоту обнаружения.

4.3 Отличная стабильность продукта

Эффекты усиления и блокирования продукта не изменяются после 10 циклов замораживания и оттаивания.
Эксперимент: красный: -20℃; зеленый: истинное замораживание-оттаивание 5 раз; синий: истинное замораживание-оттаивание 8 раз; фиолетовый: истинное замораживание-оттаивание 10 раз.
Сайт: L858R

Рисунок 5 демонстрирует, что повторное замораживание и оттаивание реагента 13755 десять раз не оказывает влияния на его амплификационные и блокирующие свойства.

Его усиливающие и блокирующие эффекты не изменяются при температуре 37 °C в течение 7 дней.
Эксперимент: Красный: -20°C; Зеленый и фиолетовый: 37°C в течение 7 дней.
Сайт: L858R

Рисунок 6 демонстрирует, что семь дней при 37°C не оказывают влияния на амплификацию и блокирующую активность реагента 13755.

5. Как люди заказывают товары?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., основанная в 2014 году, является высокотехнологичным предприятием, занимающимся НИОКР и производством сырья для инструментальных ферментов и антигенных антител. Ее продукция включает молекулярные диагностические ферменты, белки и антитела, используемые в фармацевтике, тестировании безопасности пищевых продуктов, селекции, правосудии и других отраслях. Мы стремимся предоставлять клиентам в области наук о жизни высококачественные продукты и услуги. Продукты, которые может предоставить Yeasen, следующие:

Таблица 1: Продукция, предоставленная Yeasen