С марта 2022 года коварный мутантный штамм Омикрон снова нарушил мирную жизнь людей, эпидемии нового коронавируса вспыхнули по всей стране и охватили 30 провинций (автономных районов и муниципалитетов). Как эффективное средство точной профилактики и контроля эпидемии SARS-CoV-2, обнаружение нуклеиновых кислот стало нормальным образом жизни. «Вы делали сегодня тест на нуклеиновую кислоту?» Это также стало ежедневным приветствием людей. Кстати, знаете ли вы, какое основное сырье необходимо для обнаружения нуклеиновых кислот? В этой статье будет представлено критическое основное сырье в ферменте обнаружения нуклеиновых кислот.

1. Процесс обнаружения нуклеиновой кислоты для SARS-CoV-2

2. Основные ферменты в экстракции нуклеиновых кислот

3. Основные ферменты во время ОТ-ПЦР

4. Основные ферменты обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 от Yeasen

1. Процесс обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2

Фермент — чрезвычайно важный класс биокатализаторов с высокой каталитической эффективностью и специфичностью реакции. Большинство биохимических реакций требуют участия ферментов. В процессе обнаружения нуклеиновых кислот 2019-nCoV (показано на рисунке 1) различные типы молекулярных ферментов играют важную роль на различных экспериментальных этапах, таких как извлечение нуклеиновых кислот и ОТ-кПЦР. Далее, в соответствии с различными экспериментальными связями в обнаружении нуклеиновых кислот, мы отсортируем основное сырье для ферментов, используемое в процессе обнаружения нуклеиновых кислот.

Рисунок 1. Процесс обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2

2. Основные ферменты в экстракции нуклеиновых кислот

Процесс выделения нуклеиновой кислоты нового коронавируса в основном включает два этапа: лизис и очистку. Лизис — это процесс разрушения клеточной структуры образца, в результате чего нуклеиновая кислота в образце становится свободной в системе лизиса; Очистка — это полное отделение нуклеиновой кислоты от других компонентов в системе лизиса, таких как белок, соль и другие примеси, а процесс реакции требует участия протеиназы К, дезоксирибонуклеазы I и ингибиторов РНКазы.

2.1 Протеаза К

Протеиназа К — сериновая протеаза с широкой активностью расщепления, сайтами расщепления являются карбокси-концевые пептидные связи алифатических и ароматических аминокислот (рисунок 2). В процессе извлечения нуклеиновых кислот протеиназа К может разрушать гистоны, которые прочно связаны с нуклеиновыми кислотами, способствовать разделению нуклеиновых кислот и облегчать извлечение нуклеиновой кислоты образца. Кроме того, протеиназа К может разрушать активность РНК-гидролазы (РНКазы) и ингибировать гидролиз РНКазы шаблонной РНК.

Рисунок 2. Схематическая диаграмма протеиназы К, гидролизующей пептидные связи.

Йесен Биотех Протеиназа К (Cat#10401ES) получен из рекомбинантного штамма дрожжей, удельная активность ≥30 U/мг, не содержит РНКазы и ДНКазы, стабильная активность фермента в мочевине и растворе SDS. Он активен в широком диапазоне pH (pH 4,0~12,0), подходит для расщепления и удаления белков, например, для подготовки образцов гибридизации in situ и очистки нуклеиновых кислот.

2.2 Дезоксирибонуклеаза I

Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) может катализировать различные формы ДНК, расщеплять фосфодиэфирные связи, прилегающие к пиримидинам, и образовывать полинуклеотиды с фосфатной группой на 5'-конце и гидроксильной группой на 3'-конце; средний продукт переваривания представляет собой наименьший политетрануклеотид.В процессе выделения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 ДНКаза I в основном используется для удаления геномных загрязнений в образцах РНК, предотвращения наличия остатков ДНК в матрицах РНК и повышения чистоты матриц.

Йесен Биотех ДНКаза I (Cat#10325ES) получен из рекомбинантных штаммов E. coli, не содержит РНКазы и может использоваться для обработки различных образцов РНК. Оптимальный рабочий диапазон pH составляет 7,0-8,0. В присутствии Mg2+ ДНКаза I может расщеплять любой участок двухцепочечной ДНК случайным образом; в то время как в присутствии Mn²⁺ДНКаза I может расщеплять двухцепочечную ДНК в одном и том же месте, образуя тупые концы или липкие концы длиной 1-2 нуклеотида (показано на рисунке 3).

Рис. 3. Схематическая диаграмма расщепления ДНКазой I двухцепочечной ДНК в присутствии Mg²⁺ и Мн²⁺

2.3 Ингибитор РНКазы

В процессе обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, извлечение и очистка образца нуклеиновой кислоты или подготовка экспериментальной реакционной системы могут привести к загрязнению рибонуклеазой (РНКазой), что приведет к деградации шаблона РНК. Чтобы избежать загрязнения РНКазой, требуется ингибитор РНКазы.

Ингибитор РНКазы — специфический ингибитор РНКазы в плаценте человека, который может специфически связывать РНКазу, образуя комплекс с нековалентной связью и инактивируя РНКазу. Yeasen Biotech Ингибитор мышиной РНКазы (Cat#10603ES) не содержит двух цистеинов, которые очень чувствительны к окислению в белках человека. Он обладает более высокой антиоксидантной активностью и может широко ингибировать различные типы РНКаз (РНКаза A, B, C), более подходит для экспериментов, чувствительных к высокому дитиотреитолу (DTT), например, для qPCR.

3. Основные ферменты во время ОТ-ПЦР

После завершения извлечения нуклеиновой кислоты из образца SARS-CoV-2, обнаружение нуклеиновой кислоты может быть завершено с помощью ОТ-ПЦР. В процессе этих экспериментов ДНК-полимераза, обратная транскриптаза и урацил-ДНК-гликозилаза являются основными исходными материалами для основных ферментов.

3.1 Обратная транскриптаза

После экстракции и очистки РНК SARS-CoV-2 нуждается в обратной транскриптазе для катализа полимеризации dNTP с целью получения последовательности кДНК, комплементарной шаблонной РНК (рисунок 4). Для реакции ОТ-ПЦР следует выбрать обратную транскриптазу, устойчивую к высоким температурам. В настоящее время наиболее широко используется обратная транскриптаза MMLV, поскольку из-за отсутствия у нее активности эндонуклеазы ДНК и низкой активности РНКазы H она имеет больше преимуществ при применении клонирования кДНК.

Рисунок 4. Схематическая диаграмма процесса обратной транскрипции.

Йесен Биотех Hifair™ V Обратная транскриптаза (Cat#11300ES) — это новая обратная транскриптаза, полученная с помощью генно-инженерной технологии. Она обладает хорошей термостабильностью и выдерживает температуру реакции до 60°C. А также подходит для обратной транскрипции РНК-матриц со сложными вторичными структурами. В то же время фермент усиливает сродство к матрице, подходит для обратной транскрипции небольшого числа матриц и низкокопийных генов и может амплифицировать кДНК до 10 кб.

3.2 ДНК-полимераза

После завершения процесса обратной транскрипции матрицы для получения двухцепочечной кДНК в реакции ПЦР должна появиться ДНК-полимераза «игрока души», которая полимеризует свободные дезоксирибонуклеотиды для удлинения цепи ДНК, и большое количество ДНК-матрицы амплифицируется in vitro для достижения цели обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты.

ДНК-полимераза, обычно используемая в реакциях ОТ-ПЦР, — это ДНК-полимераза Taq с горячим стартом. Этот тип фермента неактивен при комнатной температуре.Он проявляет полимеризационную активность только после горячего старта, что может минимизировать генерацию фоновых сигналов. Он решает проблемы неспецифической амплификации, вызванной генерацией димера праймера или несоответствием в обычных реакциях ПЦР. В настоящее время широко используемые методы модификации ДНК-полимеразы с горячим стартом в основном включают химическую модификацию, модификацию лиганда и модификацию антитела. Принципы различных методов модификации с горячим стартом показаны на рисунке 5.

Рисунок 5. Схематическая диаграмма различных типов модифицированных ферментов горячего старта.

Йесен Биотех Высокоспецифичная ДНК-полимераза Taq UNICONTM Hotstart, 5 U/μL (Cat#10726ES) — это двойная блокировка горячего старта ДНК-полимеразы с высоким сродством к матрице. При комнатной температуре не только 5'→3' активность полимеразы блокируется, но также 5'→3' Активность экзонуклеазы блокируется. Денатурация при 95°C в течение 30 сек может полностью инактивировать блокирующее антитело, высвобождая активность ДНК-полимеразы и экзонуклеазы. Функция двойной блокировки может не только эффективно предотвращать неспецифическую амплификацию, вызванную несовпадениями или димерами праймеров, но и эффективно ингибировать снижение сигнала флуоресценции, вызванное деградацией зонда. Двойная гарантия делает реагенты для обнаружения in vitro более стабильными во время транспортировки или использования при комнатной температуре.

3.3 Урацил-ДНК-гликозилаза

В процессе обнаружения нуклеиновых кислот нового коронавируса аэрозольное загрязнение рабочей среды является наиболее распространенным фактором, вызывающим ложноположительные результаты ПЦР. Добавление фермента UDG (Uracil DNA Glycosylase, урацил ДНК гликозилаза) в систему амплификации может эффективно устранить остаточные загрязнители амплификации (в основном в виде аэрозолей), смешанные в системе ПЦР, для обеспечения точности результатов амплификации. Принцип борьбы с загрязнением фермента UDG показан на рисунке 6.

Рисунок 6. Схематическая диаграмма принципа действия фермента UDG против загрязнения окружающей среды.

Йесен Биотех Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG/UNG), термолабильная, 1 U/мкл (Cat#10303ES) активна при 25-37°C, чувствительна к теплу и необратимо инактивируется при 50°C в течение 10 мин или 95°C в течение 2 мин. Остатки эндонуклеазы и РНКазы отсутствуют, а остаток генома бактерии-хозяина составляет менее 10 копий. Ее можно использовать в сочетании с ДНК-полимеразой Taq горячего старта для обеспечения специфичности реакции амплификации.

4.Основные ферменты обнаружения нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 от Yeasen

По поводу чтения:

Выбор обратной транскриптазы

YEASEN Термолабильный UDG ——Легко контролирует аэрозольное загрязнение

Ингибиторы мышиной РНКазы — успешно устраняют загрязнение РНКазой и сохраняют РНК