dNTP означает узорчатый рибонуклеотидтрифосфат, используемый в ПЦР, способный амплифицировать растущую цепь ДНК. Другими словами, dNTP в ПЦР связываются с комплементарными цепями ДНК через водородные связи, а растущие цепи ДНК расширяются с помощью ДНК-полимеразы Taq. Каково конкретное применение dNTP в ПЦР? Какими свойствами должны обладать высокочистые dNTP?

1. Что такое dNTP?
2. Какова концентрация dNTP в ПЦР?
3. Каковы требуемые свойства высокочистого dNTP?
4. Сопутствующие товары и производительность

1. Что такое dNTP?

Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) — это нуклеозидтрифосфаты, содержащие дезоксирибозу, цепочку нуклеотидов, состоящую из рибозы, основания и фосфата. dNTP являются основными строительными блоками молекул нуклеиновых кислот и, как таковые, являются необходимыми компонентами смесей ПЦР, поскольку без них не может быть получена новая амплифицированная ДНК. Четыре отдельных дезоксинуклеотида, которые составляют последовательность ДНК, включают дезоксиаденозинтрифосфат (dATP), дезокситимидинтрифосфат (dTTP), дезоксицитидинтрифосфат (dCTP) и дезоксигуанозинтрифосфат (dGTP). Кроме того, качество dNTP также имеет решающее значение для успеха многих процедур, таких как ПЦР, синтез кДНК, qPCR, секвенирование, клонирование и маркировка ДНК.

Существует четыре типа dNTP, или дезоксинуклеотидтрифосфата, каждый из которых использует разное основание ДНК: аденин (dATP), цитозин (dCTP), гуанин (dGTP) и тимин (dTTP). Использование dNTP во время фазы расширения обеспечивает отдельные основания, готовые войти в ДНК и удвоить ее, как строительные блоки. Поскольку целью техники является синтез новой ДНК, dNTP обеспечивает нуклеотиды для «распакованной» цепи, используя шаблон одной стороны. Это превращает одну цепь ДНК в две, и может продолжаться экспоненциально, пока реагенты присутствуют до финальной стадии удержания.

2. Какова концентрация dNTP в ПЦР?

ПЦР — это метод синтеза ДНК in vitro, который выполняется для создания множественных копий интересующего фрагмента ДНК, чтобы его можно было визуализировать с помощью гель-электрофореза. Целью ПЦР является создание большого количества копий ДНК для различных последующих применений в секвенировании ДНК или ДНК-микрочипах. Его компоненты включают ДНК-матрицы, праймеры, буферы и ДНК-полимеразу Taq dNTP. Чтобы понять механизм ПЦР, необходимо понимать важность и принцип действия используемых компонентов. dNTP является одним из ключевых компонентов ПЦР. Функция dNTP в ПЦР заключается в амплификации растущей цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы Taq и в объединении с комплементарной цепью ДНК посредством водородных связей.

Процесс ПЦР делится на три зависящих от температуры этапа: денатурация, отжиг и удлинение. На этапе денатурации двухцепочечная ДНК денатурируется в одноцепочечную ДНК. На этапе отжига праймеры связываются в точном месте их комплементарной последовательности, а на этапе удлинения Taq ДНК-полимераза добавляет dNTP к растущей цепи ДНК. Как только цепи открыты и праймеры связываются с одноцепочечной ДНК, Taq ДНК-полимераза начинает свою каталитическую активность. На следующем этапе начинается добавление dNTP, которые связываются с комплексом P-ДНК с меньшим сродством, если присутствует точный комплементарный нуклеотид. Вскоре после того, как Taq ДНК-полимераза удерживается, происходят взаимодействия водородных связей между комплементарными основаниями и dNTP. Здесь не весь нуклеотид в начале, а основание (азотистое основание) на dNTP решает, связываться или нет.Во-первых, если он находит комплементарное основание (A для T, G для C) на шаблоне ssDNA, он образует водородную связь между ними. Образуются три водородные связи между C и G и две водородные связи между A и T. После образования водородной связи Taq ДНК-полимераза выполняет включение dNTP в растущую цепь ДНК, образуя фосфодиэфирную связь. Теперь, после образования фосфодиэфирной связи, Taq ДНК-полимераза делает еще один шаг, добавляя новые dNTP. Фосфодиэфирная связь образуется между 3'OH праймера и 5'P dNTP. После образования водородной связи Taq ДНК-полимераза катализирует реакцию, удаляя гамма- и бета-фосфаты из трифосфатов dNTP. После завершения реакции высвобождаются два пирофосфата (PPi). Но точная кинетика взаимодействия dNTP и Taq-полимеразы в реакциях ПЦР остается неизвестной.

Эти четыре нуклеотида обычно добавляются в реакцию ПЦР в эквимолярных количествах для оптимального включения оснований. Однако в определенных ситуациях, таких как случайный мутагенез с помощью ПЦР, намеренно добавляются несбалансированные концентрации dNTP, чтобы способствовать более высокой степени неправильного включения некорректирующей ДНК-полимеразой. Фактором, определяющим минимальную концентрацию dNTP, является длина ДНК и состав целевой последовательности. В реакции ПЦР dNTP обычно составляет 50-200 мкмоль/л. Когда конечная концентрация dNTP превышает 50 ммоль/л, она может ингибировать активность ДНК-полимеразы Taq. Концентрации четырех dNTP должны быть равны, чтобы уменьшить неправильное включение во время амплификации из-за отсутствия одного dNTP.

В обычных применениях ПЦР рекомендуемая конечная концентрация каждого dNTP обычно составляет 0,2 мМ. Более высокие концентрации могут быть полезны в некоторых случаях, особенно в присутствии высоких концентраций Mg²⁺, как Mg²⁺ связывается с dNTP и снижает скорость их включения, увеличивая неспецифическую скорость. dNTP содержит фосфат, который может соединяться с Mg²⁺ для снижения концентрации свободного Mg²⁺, поэтому изменение его концентрации повлияет на эффективную концентрацию Mg²⁺. В условиях высокой концентрации ДНК и dNTP Mg²⁺ Концентрация должна быть скорректирована соответствующим образом. Кроме того, дефицит dNTP приводит к неполному продукту ПЦР. Однако dNTP, превышающие оптимальные концентрации, могут ингибировать ПЦР. Для эффективного включения ДНК-полимеразой свободные dNTP должны присутствовать в реакции в концентрации не менее 0,01-0,015 мМ.

3. Каковы требуемые свойства высокочистого dNTP?

С момента своего открытия полимеразная цепная реакция является непревзойденным инструментом, используемым в молекулярно-генетических исследованиях. dNTP используется в ПЦР для расширения растущей цепи ДНК. Даже если качество dNTP в системе плохое, это окажет негативное влияние на свойства конечного продукта. Высокочистый dNTP от Yeasen подходит для всех видов высокочувствительных и воспроизводимых приложений синтеза ДНК.

Yeasen предлагает готовые к использованию нуклеотиды, наборы и смеси GMP-класса, поставляемые в виде натриевых солей в очищенной воде с pH 7,0. Производственный процесс устраняет примеси и ингибиторы, специфичные для ПЦР, а dNTPs специально производятся для молекулярно-биологических приложений. dNTPs очищаются с помощью препаративной ВЭЖХ и обладают чистотой не менее 99%. Их можно использовать в процессах ПЦР, ОТ-кПЦР, LAMP, маркировки ДНК и секвенирования ДНК.
Строгие стандарты контроля и передовые технологии гарантируют наилучшее качество продукта. Каждая партия dNTP тестируется на различные остатки (бактериальная ДНК, человеческая ДНК, ДНКаза, РНКаза, эндонуклеаза).Продукт стабилен от партии к партии и подходит для всех видов высокочувствительных и воспроизводимых приложений по синтезу ДНК.

4. Сопутствующие товары и производительность

4.1 Отсутствие остатков бактериальной ДНК

Рисунок 1. Результаты обнаружения показывают, что dNTP не имеют остатков бактериального генома.

4.2 Отсутствие остатков человеческой ДНК

Рисунок 2. Результаты обнаружения показывают, что dNTP не имеют остатков человеческого генома.

4.3 Отсутствие загрязнения ДНКазой, РНКазой и эндонуклеазой

Рисунок 3. Результаты обнаружения показывают, что dNTP не содержат ДНКазу, РНКазу и эндонуклеазу.

4.4 ПЦР-амплификация (20 кб ДНК)

Рисунок 4. Результат ПЦР-амплификации — ожидаемый продукт размером 20 кб.

4.5 Информация о продукции

Компания Yeasen предлагает следующую продукцию.

Таблица 1.Информация о продукции