ПЦР (полимеразная цепная реакция) — краеугольный камень молекулярной биологии, широко используемый для клонирования генов, диагностического тестирования и исследований. Хотя это быстрый, эффективный и высокоспецифичный метод, даже опытные исследователи иногда могут столкнуться с тонкими подводными камнями, которые могут повлиять на результат их экспериментов. Чтобы помочь вам устранить неполадки и оптимизировать ваши эксперименты ПЦР, мы составили это бесплатное руководство с 5 важными советами, которые вы, возможно, не рассматривали. Тонкая настройка этих мелких деталей позволит вам увидеть лучшие результаты, улучшенные выходы и меньше неспецифических амплификации.
принцип ПЦР
Понимание ПЦР: Основы
По своей сути ПЦР амплифицирует определенный сегмент ДНК, повторяя серию этапов, зависящих от температуры: денатурация, отжиг и удлинение. В ходе этих циклов фермент ДНК-полимераза синтезирует новые нити ДНК, удваивая количество ДНК с каждым циклом. После достаточного количества циклов ваш целевой фрагмент ДНК становится обнаруживаемым.
Выход ПЦР обычно следует экспоненциальной кривой роста, с удвоением ДНК на каждом цикле, пока не достигнет фазы плато. Стандартная формула ПЦР:
Выход продукта ПЦР = 2^N копий (где N — количество циклов).
Однако по мере увеличения циклов такие реагенты, как Taq-полимераза, dNTP и праймеры потребляются, и побочные продукты могут накапливаться, что приводит к плато.
кривая амплификации ПЦР
Понимание и оптимизация этой кривой являются ключом к получению высококачественных результатов ПЦР.
1.Регулировка Условия проведения цикла ПЦР
Одним из наиболее важных шагов в оптимизации ПЦР является настройка параметров циклирования.
Ошибка №1: слишком мало циклов
Если вы не проведете достаточно циклов, особенно при низких концентрациях шаблонов, ваша целевая ДНК может не амплифицироваться адекватно. Обычно для надежной амплификации рекомендуется 30-40 циклов. Если ваш шаблон разрежен, не бойтесь использовать более высокую границу этого диапазона.
Ошибка №2: слишком много циклов
Хотя может показаться заманчивым увеличить количество циклов для повышения выхода, чрезмерное циклирование может привести к неспецифическим амплификациям и ложным положительным результатам. Реакция обычно достигает максимального выхода после 25-35 циклов, после чего она переходит в фазу плато, где не происходит существенного увеличения продукта.
Кончик: Чтобы избежать этого, используйте высокоэффективный ПЦР-реагент, такой как Мастер-микс для ПЦР Hieff® Ultra-Rapid II HotStart (кат. № 10167ES), что позволяет уменьшить застой реакции и достичь высоких выходов всего за 30–35 циклов.
Рисунок 1: 10167 амплифицирует колонию E. coli размером 576 п.н. с источником гена из Arabidopsis thaliana, превосходя продукты конкурентов. Время удлинения составляет 30 сек/кб, а амплификация проводилась с 34 циклами.
2.Совершенствуйте дизайн своего праймера
Разработка праймеров — основа любого эксперимента ПЦР, и небольшие ошибки здесь могут сорвать всю реакцию.
Ошибка №1: Игнорирование композиции 3'-конца
Хотя многие исследователи фокусируются на содержании GC и длине праймера, 3'-конец вашего праймера является решающим фактором. В идеале последние несколько оснований должны быть G или C, чтобы повысить стабильность связывания праймера с матрицей и уменьшить ошибочное запоминание или несоответствия.
Ошибка №2: Неправильная концентрация праймера
Если концентрация праймера слишком высока, вы рискуете увеличить вероятность образования димеров праймера или неспецифического связывания. И наоборот, если она слишком низкая, вы можете не достичь достаточной амплификации. Оптимальная конечная концентрация праймера обычно составляет от 0,4 до 0,5 мкМ.
Кончик: Придерживайтесь надежной концентрации около 0,4–0,5 мкМ для ваших прямых и обратных праймеров, как рекомендовано Мастер-микс для ПЦР Hieff® Ultra-Rapid II HotStart комплект. Последовательность здесь гарантирует меньше ошибок и более надежные результаты.
| Компоненты | Объем (мкл) | Объем (мкл) | Конечная концентрация |
| 2×Хифф® Мастер-микс Ultra-Rapid II HotStart PCR* | 25 | 12.5 | 1× |
| Шаблон** | х | х | - |
| Прямой праймер F（10 мкМ）*** | 2 | 1 | 0,4-0,5 мкМ |
| Обратный праймер R （10 мкМ） | 2 | 1 | 0,4-0,5 мкМ |
| ддх2О | До 50 | До 25 | - |
3. Помните о качестве и количестве ДНК-матрицы
ДНК-матрица играет ключевую роль в реакциях ПЦР, и проблемы с качеством или концентрацией могут привести к плохой амплификации.
Ошибка №1: Деградация шаблонной ДНК
ДНК может со временем деградировать, особенно если она не хранится должным образом. Регулярно проверяйте концентрацию шаблона, особенно если он хранился в течение длительного периода.Всегда проводите повторную количественную оценку ДНК перед началом эксперимента, чтобы обеспечить точность результатов.
Ошибка №2: Неправильные методы работы с шаблонами
Для некоторых организмов, таких как дрожжи, подготовка шаблона может иметь решающее значение. Например, при работе с дрожжами кипячение клеток в течение 5 минут, а затем замораживание их при температуре -80°C в течение 3 минут перед размораживанием может значительно улучшить выход ПЦР.
10167ES Амплификация дрожжей
Кончик: Всегда используйте свежеприготовленную и хорошо количественно определенную ДНК-матрицу. Если вы работаете с более сложными матрицами (например, дрожжами), рассмотрите возможность оптимизации протоколов экстракции для достижения лучших результатов.
4. Избегайте загрязнения реагентов.
Загрязнение реагентов часто является упускаемой из виду причиной неудачной ПЦР. Сюда входит как физическое загрязнение от пипеток, так и перекрестное загрязнение между реагентами.
Ошибка №1: Перекрестное загрязнение реагентов
Реагенты ПЦР, такие как праймеры, часто подвергаются многократным циклам замораживания-оттаивания, что может увеличить риск заражения. Крайне важно всегда добавлять праймеры в качестве одного из последних компонентов вашей реакции, чтобы минимизировать этот риск.
Ошибка №2: Неспецифическая амплификация
Если праймеры добавляются в неправильном порядке или наконечники пипеток не меняются между каждым шагом, может произойти перекрестное загрязнение между реакциями, что приведет к неспецифической амплификации.
Кончик: Соблюдайте оптимальный порядок добавления реагентов: вода → праймеры → шаблон → ферменты ПЦР-микса. Это помогает избежать проблем с загрязнением и сохраняет чистоту и надежность ваших реакций.
5. Выберите правильную смесь для ПЦР и добавки
Не все смеси для ПЦР одинаковы, и выбор правильной смеси может иметь решающее значение для успеха вашего эксперимента.
Ошибка №1: использование некачественных смесей для ПЦР
Некоторые смеси для ПЦР менее эффективны при работе со сложными шаблонами или высоким содержанием ГЦ. Для сложных реакций рассмотрите возможность использования высокопроизводительной смеси, разработанной для быстрой и эффективной амплификации.
Кончик: Мы рекомендуем использовать Мастер-микс Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR (кат. № 10167ES), что обеспечивает более быстрое время расширения и лучшую производительность со сложными шаблонами. Его способность обрабатывать высокое содержание GC и большие фрагменты не имеет себе равных, обеспечивая вам более высокие выходы за более короткие периоды.
Демонстрация производительности
- Быстрое и эффективное увеличение колоний
Рисунок 1: Тест амплификации с экстремальным временем удлинения для колонии E. coli. Для фрагментов размером в 3 кб 10167ES достигает эффективности расширения 1 с/кб, для фрагментов размером 6 кб эффективность удлинения составляет 3 сек/кб, а для фрагментов размером 6-10 кб эффективность достигает 5 сек/кб. M: 10,000 DNA Marker (10505ES).
- Быстрая и эффективная амплификация длинных фрагментов и бактериальных жидкостей с высоким содержанием GC
Рисунок 2: Амплификация длинных фрагментов и бактериальных жидкостей с высоким содержанием углерода показывает, что 10167ES дает более высокие результаты со 100%-ным уровнем обнаружения, превосходя конкурирующие продукты.. M: 10 000 ДНК-маркеров (10505ES). Скорость расширения 10167ES составляет 10 сек/кб, тогда как у конкурентов это занимает 15 сек/кб.
Заключение: мелкие детали, большое влияние
Оптимизация ПЦР заключается не только в пошаговом следовании протоколу, но и в понимании того, как небольшие изменения могут значительно улучшить ваши результаты. От тонкой настройки условий циклирования до обеспечения качества ваших реагентов, внимание к этим деталям может сделать или погубить ваш эксперимент ПЦР.
Уделяя время оптимизации протоколов и используя правильные реагенты, такие как Мастер-микс для ПЦР Hieff® Ultra-Rapid II HotStart, вы можете значительно повысить эффективность и выход ПЦР. Помните, в сфере ПЦР дьявол кроется в деталях.
Готовы улучшить результаты ПЦР? Ознакомьтесь с нашими продуктами сегодня и позвольте Hieff® Ultra-Мастер-микс для ПЦР Rapid II HotStart поднимите свои исследования на новый уровень!
О Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix
Эта смесь для ПЦР нового поколения разработана для быстрой, эффективной и высокопроизводительной амплификации. Работаете ли вы с бактериальными колониями, сложными шаблонами или высоким содержанием GC, эта смесь поможет вам достичь оптимальных результатов за меньшее время и меньшее количество циклов.
Обновленная версия Fast PCR Master Mix
2×Хифф® Мастер-микс Ultra-Rapid II HotStart PCR
Быстро, эффективно, останавливает застой и увеличивает урожайность
| Позиционирование продукта | Имя | Номер по каталогу | Технические характеристики |
| Модернизированная быстрая ПЦР, подходящая для бактериальной ПЦР и комплексной шаблонной амплификации | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 1 мл/5×1 мл | |
| Самое быстрое 5-минутное одношаговое клонирование для 1-7 фрагментов. | Hieff Clone® Universal II Одношаговый набор для клонирования | 20 т/50 т |
Для получения дополнительной информации или покупки посетите наш официальный сайт.