Набор для высокоэффективного синтеза РНК T7 оптимизирует систему реакции транскрипции. Набор может эффективно синтезировать одноцепочечную РНК, используя РНК-полимеразу T7, линейную двухцепочечную ДНК с последовательностью промотора T7 в качестве шаблона и NTP в качестве субстрата для управления последовательностью ДНК ниже промотора. Во время транскрипции к субстрату можно добавлять модифицированные нуклеотиды для получения РНК, меченой биотином или красителем.

1. Введение в набор для высокоэффективного синтеза РНК T7
2. Принципы в пробирке транскрипция
3. Преимущества набора Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit
4. Эксплуатационные характеристики продукта
5. Как использовать этот набор
6. Часто задаваемые вопросы
7. Информация о заказе

1. Введение в набор для высокоэффективного синтеза РНК T7

T7 High Yield RNA Synthesis Kit может синтезировать как длинные транскрипты, так и короткие транскрипты, и РНК может быть произведена в количестве 100-200 мкг с 1 мкг ДНК-шаблона. Синтезированная РНК может быть использована для различных последующих приложений, таких как исследование структуры и функции РНК, защита РНКазы, гибридизация зондов, РНК-интерференция, микроинъекция и в пробирке перевод.

2. Принципы в пробирке транскрипция

Рисунок 1. В пробирке процесс транскрипции

3. Преимущества набора Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit

Чрезвычайно высокая производительность — до 200 мкг за 2 часа
Универсальный — подходит для транскриптов РНК длиной от 20 до 10000 нуклеотидов
Многоцелевое использование — генерирует немеченую, меченую или кэпированную РНК

4. Эксплуатационные характеристики продукта

Рисунок 2. Сравнение доходности IVT

Примечание: Все реагенты для реакции взяты из Набор для синтеза РНК Т7 (Yeasen#10623 или компания B*). Выходы реакции IVT компаний Yeasen и B* показаны выше.

Рисунок 3. Качество транскрипционных продуктов разной длины

Рисунок 4. Уровень экспрессии транскрибированной мРНК в клетках HEK-293

Примечание: мРНК покрыта ферментом, блокирующим вирус коровьей оспы (Yeasen#10614/10615).

5. Как использовать этот набор

5.1 Размораживание реагентов

Центрифугируйте смесь РНК-полимеразы Т7 в течение короткого времени и поместите на лед. Разморозьте 10-кратный буфер транскрипции и рибонуклеотиды (АТФ, ЦТФ, ГТФ, УТФ), смешайте и центрифугируйте до дна пробирки, поместите 10-кратный буфер транскрипции при комнатной температуре и поместите четыре типа рибонуклеотидов на лед.

5.2 Подготовьте систему реакции транскрипции в соответствии со следующей таблицей.

Таблица 1.Методика приготовления системы реакции транскрипции

Примечание:
a) Реакция готовится при комнатной температуре. Поскольку 10× буфер транскрипции содержит спермидин, слишком высокая концентрация спермидина при низких температурах приведет к осаждению ДНК-матрицы.
б) Короткий транскрипт (<100 нуклеотидов), можно использовать матрицу 2 мкг, время транскрипции увеличивается до 4–8 часов.
в) Для длинных транскриптов (>1000 нуклеотидов) рекомендуется использовать линеаризованные плазмидные шаблоны для транскрипции.
г) Проводите реакцию в ПЦР-аппарате с открытой горячей крышкой, чтобы предотвратить длительное испарение реакционного раствора.
e) Продукт реакции может иметь белый осадок. Это пирофосфат магния, образованный свободным пирофосфатом и ионами магния во время реакции, который не повлияет на последующие эксперименты. Вы можете добавить ЭДТА, чтобы удалить его. Если вы обеспокоены тем, что добавление ЭДТА повлияет на последующие эксперименты, супернатант также можно получить центрифугированием.
е) Реагенты и контейнеры не должны быть загрязнены РНКазой.

5.3 Инкубируйте при температуре 37°C в течение 2 часов.

Смешать вышеуказанный реакционный раствор, кратковременно центрифугировать до дна пробирки и инкубировать при 37°C в течение 2 ч. Если длина транскрипта составляет менее 100 нт, увеличьте время реакции до 4–8 ч.

5.4 Обработка ДНКазой I (необязательно)

После завершения реакции добавьте в каждую пробирку по 2 мкл ДНКазы I (без РНКазы) и инкубируйте при температуре 37°C в течение 15 минут для удаления шаблонной ДНК.

6. Часто задаваемые вопросы

6.1 Выход реакции IVT низкий

Качество шаблона тесно связано с выходом. Если выход экспериментальной группы значительно ниже, чем у группы положительного контроля, возможными причинами могут быть.
① Шаблоны содержат компоненты, которые будут ингибировать реакцию IVT.
② Что-то не так с шаблонами.

6.2 Предложения

① Повторно очистите шаблон.
② Подтвердите концентрацию и целостность шаблонов.
③ Увеличьте время реакции.
④ Увеличьте ввод шаблона.
⑤Попробуйте другие РНК-полимеразы и соответствующие промоторы.

6.3 Выход коротких транскриптов низок

Если целевые транскрипты короче 100 нуклеотидов, увеличьте время реакции до 4–8 часов или увеличьте ввод матриц до 2 мкг в реакционной системе объемом 20 мкл.

6.4 Есть неожиданно длинные стенограммы

Если результат гель-электрофореза показывает, что имеются неожиданно более длинные транскрипты, возможными причинами могут быть:
① Шаблоны плазмид могут быть не полностью линеаризованы.
②Шаблоны имеют сплоченные концы с выступами длиной 3 фута.
③Транскрипты имеют вторичную структуру, которая не полностью денатурирована.

6.5 Предложения

①Проверьте, полностью ли линеаризованы плазмидные шаблоны. При необходимости выполните линеаризацию плазмиды еще раз.
②Выберите подходящие рестрикционные ферменты для линеаризации плазмидных шаблонов и избегания образования липких концов с 3'-выступами. При необходимости можно использовать фрагмент Кленова или ДНК-полимеразу Т4 для получения тупого конца.
③Используйте денатурированный гель для обнаружения транскриптов.

6.6 Есть неожиданные более короткие стенограммы

Если результат гель-электрофореза показывает наличие неожиданных более коротких транскриптов, возможными причинами могут быть:
①В матрицах имеется последовательность, аналогичная терминальной последовательности РНК-полимеразы Т7.
②Содержание GC в шаблонах высокое.

6.7 Предложения

①Уменьшите температуру реакции (например, до 30℃), но учтите, что иногда уменьшение температуры реакции приводит к снижению выхода.
②Попробуйте использовать другие РНК-полимеразы для катализа реакции IVT.
③Если содержание ГЦ в шаблонах высокое, установите температуру реакции IVT на уровне 42 ℃ или добавьте SSB в реакционную систему IVT для увеличения выхода и длины транскриптов.

6.8 При электрофорезе в геле наблюдается размазывание транскриптов.

Если при электрофорезе в геле наблюдается размазывание транскриптов, то возможными причинами могут быть:
①Во время экспериментальной работы произошло загрязнение РНКазой.
②ДНК-шаблоны загрязнены РНКазами.

6.9 Предложения

①Убедитесь, что все реагенты составлены с использованием H2O, не содержащей РНКазы. Используйте наконечники пипеток и пробирки Эппендорфа, не содержащие РНКазы, а также надевайте одноразовые латексные перчатки и маски во время экспериментальной работы.
②Повторная очистка ДНК-шаблонов.

7. Информация о заказе

Ниже приведены репрезентативные продукты, предлагаемые Yeasen. Доступны дополнительные размеры. Наши продукты в высокой степени оптимизированы для совместной работы, чтобы помочь обеспечить превосходную производительность и воспроизводимость.
Мы также можем предоставить индивидуальные услуги. Если вас интересует продукт, который не показан, свяжитесь с нами, и мы поработаем с вами, чтобы удовлетворить ваши потребности.

Таблица 2.Информация о продукте

По поводу чтения:

Реагенты GMP-класса для синтеза мРНК in vitro

Yeasen Biotechnology GMP класс мРНК In Vitro Синтез Сырье