Загрязнение нуклеиновыми кислотами долгое время было существенным препятствием в развитии технологий молекулярной диагностики. По мере разработки более чувствительных методов диагностики возросла потребность в более высокой чистоте ферментов и белков. Одной из ключевых проблем в производстве белков является эффективное удаление загрязнения нуклеиновыми кислотами. Присутствие нуклеиновых кислот может поставить под угрозу функцию и активность белка, что может привести к таким проблемам, как неспецифическое связывание, ингибирование активности ферментов или усиление фоновых сигналов, что в конечном итоге влияет на точность результатов диагностики.
В результате разработка эффективных процессов удаления нуклеиновых кислот в процессе производства белка является одновременно критически важной и необходимой.
После многих лет технологических исследований компания Yeasen Biotechnology разработала закрытый интегрированный метод эффективного удаления нуклеиновых кислот. Этот процесс оптимизирует пермеабилизацию клеток, включает очистку на анион-катионообменной колонке, микрофильтрацию и ультрафильтрацию, а также включает полный контроль остатков процесса. Этот интегрированный подход обеспечивает максимальное удаление загрязнений нуклеиновыми кислотами, позволяя очищать молекулярные ферменты с ультранизкими остатками ДНК.
Комплексные стратегии предотвращения загрязнения ДНК при производстве белка
Загрязнение ДНК является распространенной проблемой в производстве биологических продуктов, существенно влияя на их чистоту, качество и точность экспериментальных результатов. Присутствие ДНК в белковых препаратах может привести к неточным экспериментальным выводам, искажению данных и потенциальному увеличению вероятности ложноположительных результатов. Для исследователей и производителей, занимающихся производством белков, реализация эффективных стратегий по предотвращению и смягчению загрязнения ДНК имеет важное значение. В этой статье рассматривается, как избежать загрязнения ДНК, особенно загрязнения воздушно-капельным путем, и описываются методы эффективного удаления ДНК из образцов белка.
Я. Предотвращение загрязнения ДНК в воздухе
Загрязнение ДНК в воздухе остается критической проблемой в производстве белка, особенно в средах, где необходим контроль микробов и частиц. Чтобы минимизировать риск загрязнения ДНК в воздухе, следует использовать следующие стратегии:
| 1. Создание чистой среды помещения Проведение производства белка в чистом помещении обеспечивает контролируемую среду, необходимую для минимизации количества частиц и микробов в воздухе, которые могут привести к загрязнению ДНК. Чистые помещения должны соответствовать определенным стандартам чистоты, чтобы гарантировать отсутствие загрязнений в атмосфере. | 2. Внедрение систем фильтрации HEPA Системы очистки воздуха, оснащенные фильтрами HEPA, необходимы для улавливания взвешенных в воздухе частиц, включая пыль, микробные загрязнители и фрагменты ДНК. Эти фильтры помогают поддерживать чистый воздух на всем производственном объекте. |
| 3. Поддержание положительного давления в окружающей среде Положительное давление среды предотвращает проникновение загрязненного воздуха извне контролируемого пространства. Поддержание более высокого давления воздуха внутри производственной зоны по сравнению с внешней средой гарантирует, что любые утечки приведут к выходу воздуха, а не к его проникновению. | 4. Протоколы плановой очистки и дезинфекции Регулярная уборка производственной зоны с использованием соответствующих дезинфицирующих средств, таких как нуклеазы или очистители на основе хлора, может разрушить ДНК, содержащуюся в воздухе, снижая риск заражения. Это особенно важно в зонах частого контакта и на поверхностях, находящихся вблизи оборудования для производства белка. |
| 5. Ограничить перемещение персонала Минимизация перемещения персонала в чистых помещениях снижает вероятность попадания загрязняющих веществ через взаимодействие с человеком. Назначенный персонал должен следовать строгим протоколам относительно входа и выхода для контроля воздействия. | 6. Мониторинг качества воздуха Мониторинг качества воздуха в чистом помещении, включая количество микробов и уровень частиц, необходим для обеспечения постоянного соответствия производственным стандартам. Для оценки чистоты окружающей среды можно использовать пробоотборники воздуха и счетчики частиц. |
| 7. Используйте одноразовые материалы Использование одноразовых расходных материалов для производства белка значительно снижает риск перекрестного заражения, что часто случается при использовании многоразового оборудования. | 8. Закрытые производственные процессы Закрытые системы, такие как биореакторы или герметичные камеры, минимизируют воздействие открытой среды. Это снижает риск загрязнения ДНК из воздуха, особенно на критических этапах, таких как ферментация и очистка белка. |
| 9. Избегайте образования аэрозоля Образование аэрозоля во время производства белка может способствовать распространению ДНК в воздухе. Меры предосторожности, такие как осторожное обращение и перенос жидкостей без перемешивания, могут минимизировать образование аэрозоля. | 10. Использование нуклеаз Обработка поверхностей и оборудования нуклеазами до и после использования может привести к разрушению остаточной ДНК, которая может остаться после таких процессов, как лизис клеток или фильтрация. |
| 11. Внедрить изоляцию окружающей среды Для операций с высоким уровнем риска, таких как очистка и приготовление белков, использование изоляторов или перчаточных боксов обеспечивает дополнительный уровень защиты, изолируя процесс от загрязняющих веществ, находящихся в воздухе. | 12. Специальное оборудование и инструменты Использование специализированного оборудования, предназначенного исключительно для производства белка, предотвращает перекрестное загрязнение от инструментов и приборов, которые могли подвергнуться воздействию ДНК или нуклеиновых кислот в других процессах. |
| 13. План реагирования на чрезвычайные ситуации с загрязнением Эффективный план реагирования должен быть разработан для управления случайным загрязнением ДНК. Протокол должен включать быстрые шаги по идентификации, сдерживанию и восстановлению для предотвращения распространения и минимизации воздействия загрязнения. | 14. Обучение сотрудников Постоянное обучение персонала рискам заражения ДНК и важности правильных методов обращения обеспечивает внедрение передовых методов и соблюдение протоколов контроля заражения. |
II. Удаление ДНК-загрязнений из белков
Во время очистки белка удаление любого остаточного загрязнения ДНК имеет решающее значение для поддержания качества белка. Для удаления ДНК из образцов белка обычно используются несколько методов:
| 1. Мягкие методы лизиса клеток Неразрушающие буферы лизиса позволяют высвобождать белки, минимизируя при этом разрушение ДНК. Такой подход позволяет избежать неизбирательного разрушения ДНК, снижая вероятность загрязнения образца белка. | 2. Оптимизированные условия лизиса Корректировка таких факторов, как pH и ионная сила во время лизиса клеток, может предотвратить растворение ДНК, тем самым уменьшая количество загрязняющей ДНК в полученном образце. |
| 3. Ингибирование нуклеазы Использование ингибиторов протеазы, таких как фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), может предотвратить активность нуклеаз внутри клеток, что позволяет осуществлять более контролируемую и избирательную деградацию ДНК во время лизиса. | 4. Осмотический шок Осмотический шок — это мягкий метод лизиса клеток путем помещения их в раствор с резким перепадом осмотического давления. Это может помочь уменьшить высвобождение ДНК, что приведет к более чистым белковым препаратам. |
| 5. Ферментативный лизис Использование ферментов, таких как лизоцим, для разрушения клеточных стенок бактерий — это контролируемый метод лизиса, который воздействует только на клеточную мембрану, что снижает риск загрязнения ДНК во время высвобождения клеточного содержимого. | 6. Обработка после лизиса После лизиса клеток немедленное охлаждение образца может помочь снизить активность нуклеазы, которая в противном случае привела бы к дальнейшей деградации ДНК в растворе. |
III. Усовершенствованные методы удаления нуклеиновых кислот
Использование хроматографии или методов, основанных на аффинности, в последующей обработке может дополнительно удалить следовые примеси ДНК из белковых препаратов. Анионообменная и катионообменная хроматография — это два хорошо известных метода удаления ДНК-загрязнений из образцов белков. Оба метода основаны на взаимодействии между нуклеиновыми кислотами и заряженными поверхностями для селективного удаления ДНК.
| 1. Анионообменные колонки Анионообменные колонки используют положительно заряженные неподвижные фазы для привлечения и связывания отрицательно заряженных нуклеиновых кислот. Регулируя концентрацию соли в буфере элюирования, можно избирательно удалять нуклеиновые кислоты из белкового препарата. | 2. Катионообменные колонки В определенных условиях катионообменные колонки также могут использоваться для удаления нуклеиновых кислот. Увеличивая концентрацию соли или изменяя pH, нуклеиновые кислоты могут конкурентно элюироваться из колонки. |
| 3. Ультрафильтрация Ультрафильтрация использует селективную мембранную фильтрацию для отделения белков от нуклеиновых кислот, гарантируя эффективное удаление ДНК на этапах очистки. | 4. Гель-фильтрационная хроматография Гель-фильтрация — это метод гель-хроматографии, который разделяет молекулы по размеру. Нуклеиновые кислоты, будучи больше белков, эффективно разделяются, оставляя чистые образцы белков. |
IV. Сокращение загрязнения ДНК от персонала
Персонал играет значительную роль в потенциальном внесении ДНК-загрязнения в процессы производства белка. Следующие меры могут помочь снизить этот риск:
| 1. Комплексное обучение персонала Весь персонал должен пройти обучение по вопросам важности контроля за загрязнением ДНК и передовых методов предотвращения заражения. | 2. Средства индивидуальной защиты (СИЗ) Персонал должен носить соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как лабораторные халаты, перчатки, маски и защитные очки, чтобы свести к минимуму риск заражения ДНК при контакте с человеком. |
| 3. Протоколы гигиены рук Частое мытье рук и использование дезинфицирующих средств на спиртовой основе имеют решающее значение для снижения переноса ДНК с рук на поверхности и оборудование. | 4. Изменения в одежде и обуви Переодевание в специальную рабочую одежду и обувь гарантирует, что ДНК-загрязнение не будет занесено извне на производственную территорию. |
| 5. Строгие правила поведения на работе Персоналу следует воздерживаться от еды, питья и разговоров в зоне производства белка, чтобы предотвратить попадание ДНК через слюну, частицы пищи или капли. | 6. Мониторинг окружающей среды Необходимо проводить регулярный мониторинг окружающей среды, включая проверки воздуха, поверхностей и оборудования, чтобы гарантировать отсутствие загрязнения ДНК в производственной зоне. |
Заключение
Для обеспечения производства высококачественных, незагрязненных белков необходим комплексный подход к контролю загрязнения ДНК.Принимая строгие меры контроля окружающей среды, используя оптимизированные методы очистки и уделяя особое внимание обучению персонала, можно значительно минимизировать риски, связанные с загрязнением ДНК. Эти методы имеют решающее значение для поддержания целостности и надежности белковых продуктов в исследовательских и промышленных приложениях, в конечном итоге способствуя развитию разработки биологических продуктов.
Сопутствующие товары
1. UCF.ME Урацил ДНК гликозилаза (UDG/UNG), термолабильная
2. UCF.ME Ингибитор мышиной РНКазы
Преимущества продукта
- Сверхнизкий остаток геномной ДНК UCF.ME — E. coli <0,1 копий/U;
- Низкий остаток нуклеазы — отсутствие остаточной экзонуклеазы, никирующего фермента или РНКазы;
- Высокая способность к перевариванию — 0,05 U/T может переваривать 105 копий/T продуктов dU-ДНК;
- Хорошая термолабильность — полная инактивация при любых условиях: 50°C в течение 10 минут, 55°C в течение 5 минут или 95°C в течение 5 минут;
- Совместимость с системами реакции ОТ-ПЦР в реальном времени — отсутствие влияния на систему обнаружения даже при высоких уровнях входного сигнала (реакционная система 2U/20 мкл).
（1）Низкий уровень остаточных нуклеаз: отсутствие остаточных экзонуклеаз, никирующих ферментов или РНКаз
Рисунок 1. Результаты теста на остатки нуклеазы
（2）Остаток геномной ДНК E. coli < 0,1 копий/U
Рисунок 2. Результаты теста на остатки геномной ДНК E.coli
Информация о заказе
| Кот: | Имя | Приложение |
| 14321 | Hieff UNICON UCF.ME™ Advanced Hotstart Taq ДНК-полимераза | ПЦР |
| 14608 | Обратная транскриптаза Hifair UCF.ME™ V (200 ед./мкл) | ОТ-ПЦР |
| UCF.ME™ Урацил ДНК гликозилаза (УДГ/УНГ), термолабильная, 1 ед/мкл | ОТ-ПЦР | |
| УЦФ.Ингибитор мышиной РНКазы ME™ (40 ед./мкл) | ОТ-ПЦР | |
| Набор зондов Hifair™ V2 Multiplex One Step RT-qPCR (UDG Plus, GC enhancer plus) | ОТ-ПЦР | |
| Набор для синтеза двухцепочечной ДНК Hieff NGS™ | мНГС | |
| 13501 | Набор для синтеза двухцепочечной ДНК Hieff NGS™ (дигестер геномной ДНК плюс) | мНГС |
| Набор для подготовки библиотеки ДНК Hieff NGS™ OnePot Flash | мНГС | |
| 13490 | Набор для подготовки библиотеки ДНК Hieff NGS™ OnePot ll для Illumina | мНГС |
| 12946 | 10x набор для синтеза первой кДНК Hieff NGS™ | tNGS для патогена |
| 4x Hieff™ Мультиплексный набор ОТ-ПЦР | tNGS для патогена | |
| 4x Hieff™ Мультиплекс ПЦР Мастер Микс | NGS для патогена | |
| 12977 | 4x Hieff™ Multiplex PCR Master Mix 2.0 | NGS для патогена |