В данной статье описывается применение Конканавалина А и его ковалентное связывание с магнитными частицами.
Часть 1. Конканавалин А
Магнитные бусины с покрытием Concanavalin A (ConA-бусины), как следует из названия, являются биомагнитными бусинами, в которых растительный лектин Concanavalin A (ConA) соединен с суперпарамагнитными наноматериалами. Ниже приводится краткое введение в ConA Magnetic Beads.
Конканавалин А (КонА), растительный лектиновый белок, не имеющий специфичности к группе крови, был первым растительным лектиновым белком, который был выделен, очищен и кристаллизован из бобов каракатицы (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) с 1936 года.
КонА имеет 2 основные формы в зависимости от pH раствора, в котором он присутствует: гомодимер α-2 или гомотетрамер α-4. [2]. В щелочных условиях (pH>7,0) он существует в виде тетрамера (состоящего из четырех субъединиц с молекулярной массой 26 кДа); в кислых условиях (pH 4,5-5,5) Con A диссоциирует в активированную димерную структуру (52 кДа). Кроме того, на функцию ConA влияют двухвалентные катионы, например, в отсутствие ионов металлов (Ca2+ и Мн2+), его конформация и функция связывания гликопротеина не могут быть реализованы[1].
Рис. (1). Молекулярное моделирование (A) мономера ConA, (B) димера ConA, (C) тетрамера ConA с маннозой, глюкозой и ионами металлов.
Часть 2. Бисер
Биомагнитные бусины — это класс магнитных микросфер с нанометровым размером частиц, образованных полимерами и неорганическими магнитными наночастицами. Магнитные бусины можно разделить на три основные категории в зависимости от их структуры: структура типа ядро-оболочка, структура типа сэндвич и структура диффузного типа. Магнитные материалы включают чистый железный порошок, карбонильное железо, магнитную руду, ортоферрит и железо-кобальтовый сплав, и др..
Магнитные наноматериалы, из-за их особых эффектов, таких как эффект малого размера, поверхностный эффект и квантовый размерный эффект и т. д., в размере Fe3О4 наночастицы меньше 30 нм, интерференция теплового возмущения внутри наночастиц значительна, и в это время эти наночастицы проявляют особое магнитное свойство, т. е. суперпарамагнетизм. Суперпарамагнитное железо3О4 Наночастицы широко используются в биологической промышленности благодаря своим высоким качественным свойствам, таким как нетоксичность, хорошая биосовместимость, уникальные свойства магнитного нацеливания и легкость генерации тепла в переменных магнитных полях.
Напротив, ковалентное связывание КонА с микросферами для иммобилизации биомолекул имеет следующие преимущества:
- Высокая стабильность ковалентного связывания для воспроизводимости;
- Связывание лиганда ConA на поверхности микрогранул для взаимодействия с целевыми молекулами;
- Кинетическая характеристика среды раствора, пригодная для биологических экспериментальных манипуляций;
Часть 3. Применение магнитных шариков ConA
Как сообщается в литературе, основные области применения магнитных частиц ConA можно разделить на три категории: разделение цитоплазматических мембран, обогащение гликопротеинов и разделение иммобилизованных клеточных компонентов.
Приложение I: Разделение цитоплазматической мембраны
Используя магнитные шарики ConA, активируемые двухвалентными катионами, он существует в Ca2+ и Мг2+ растворы, которые обладают функцией аффинного взаимодействия терминального α-D-маннозила и α-D-глюкозила, используемые при очистке плазматической мембраны, являются простым и эффективным способом. Например, разделение клеток или тканей плазматической мембраной является ключевым шагом для дальнейшего получения белков плазматической мембраны. ConA способен связывать гликозилированные белки на клетках, и этот принцип может быть использован для получения более чистой плазматической мембраны. Основные этапы работы: иммобилизация ConA на магнитных шариках путем связывания биотинилированного ConA со стрептавидиновыми магнитными шариками; инкубация клеточных мембран с магнитными шариками ConA в течение 1 часа; адсорбция на магнитной стойке; промывка TBS в течение 5 раз; и элюирование раствора цитоплазматической мембраны элюентом[3].
Рис. 2. Этапы очистки плазматической мембраны с помощью магнитных частиц ConA
Применение II: Обогащение гликопротеинами
ConA специфичен для маннозы и глюкозы и распознает α-конъюгированную маннозу, которая является «основным олигосахаридом» многих сывороточных и клеточных мембранных гликопротеинов. Поэтому его можно использовать в иммунологии для разделения гликозилированных молекул, таких как гликопротеины, в лизатах клеток или тканей или сыворотке.
Основная процедура заключалась в том, что путем сшивания аминосиланизированных магнитных наножемчужин (МНЧ) с ConA через бифункциональный линкер, бис-N-гидроксисукцинимид линолеат (DSS), для получения магнитных шариков ConA; для прекращения неспецифического связывания магнитных наножемчужин с использованием метоксиэтиленгликоля (МЭГ) и для проведения магнитного разделения; для добавления экстракта клеточных мембранных белков, переваренных трипсином, для инкубации как магнитных шариков ConA, так и захваченных гликопептидов, и, наконец, для элюирования захваченных гликопептидов и для проведения вакуумной сушки. Магнитные шарики ConA инкубировались, магнитные шарики ConA, которые имели связанные гликопротеины, собирались магнитной стойкой, негликопептиды промывались, и, наконец, захваченные гликопептиды элюировались и высушивались в вакууме. Этот метод позволяет проводить углубленный анализ специфических участков гликозилирования опухолеассоциированных белков (например, EGFR)[4].
Рис. 3. Суперпарамагнитные наночастицы, связанные с различными лектинами.
Применение III: Изоляция иммобилизованных клеток
Использование магнитных бусин ConA (магнитные бусины, ковалентно связанные с высокочистым компаньоном Конканавалином А) для связывания с гликопротеинами на клеточных мембранах или ядерных мембранах, тем самым захватывая клетки или ядра, позволяет визуализировать экспериментальные манипуляции с небольшим количеством клеток. Например, магнитные бусины ConA используются в CUT&Tag и CUT&RUN [5] эксперименты, которые представляют собой новые методы, используемые для изучения структуры и функции хроматина, и иммобилизуются путем связывания магнитных частиц ConA с клетками для визуализации операции и избежания проблемы потери клеток, вызванной центрифугированием.
По сравнению с традиционной технологией ChIP-seq для изучения ДНК-белковых взаимодействий, CUT&Tag и CUT&RUN имеют следующие преимущества:
- Магнитные шарики ConA связываются с гликопротеинами клеточной мембраны для визуализации операции и улучшения опыта экспериментальной эксплуатации;
- Нет необходимости в центрифугировании, просто магнитные частицы ConA адсорбируются на магнитной стойке для завершения разделения образцов клеток и растворов;
- Может работать с 10 ячейками, что устраняет необходимость в большом количестве образцов для ChIP-seq.
Рис. 4. Принципиальная схема экспериментального потока ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Часть 4. Магнитные бусины YEASEN с покрытием Concanavalin A
Магнитные шарики ConA, разработанные YEASEN, способны связываться с гликопротеинами, гликолипидами, полисахаридами и другими молекулами с модификацией гликозилирования быстрым, эффективным, чувствительным и специфическим образом после строгого отбора сырья и множественной оптимизации и улучшения процесса. Он в основном используется для выделения клеток или для выделения гликозилированных молекул, таких как гликопротеины в лизатах клеток или тканей или сыворотке, и особенно напрямую используется для экспериментов, таких как CUT &RUN и CUT&Tag (инновационная технология для экспериментов ChIP-seq).
1.Характеристики продукта
- Стабильное серийное производство и лучшая воспроизводимость результатов;
- Стабильная производительность хранилища
- Эффективность захвата клеток>90%
2.Информация о продукте
| Номер кат. | Кат.№19810ES |
| Размер | 1мл/5мл/20мл |
| Цвет | Коричневато-желтый |
| Концентрация шариков | 10 мг/мл |
| Твердое содержание | 9-11 мг/мл |
| Размер бусины | 1 мкм |
| Емкость | 105 ячейки/мкл шарики |
3.Данные о производительности продукта
(1)Монодисперсность
При тех же условиях обработки и при увеличении 10×/40× гранулы ConA были в основном монодисперсными, и не наблюдалось никакой очевидной агломерации по сравнению с конкурентом.
| Бусины из сырья YEASEN | Бусины ConA конкурента | Бусины YEASEN ConA (кат. № 19810) |
Рис. 5. График результатов монодисперсности
(2)Эффект связывания клеток с гранулами ConA
Такое же количество клеток инкубировали с гранулами в течение такого же периода времени, и количество клеток, оставшихся после конъюгации гранул ConA, автоматически определялось с помощью клеточного анализатора, и результаты показали, что YEASEN Бусины ConA (кат. № 19810) превзошли продукцию конкурентов.
| Суспензия клеток | Клетки, оставшиеся после связывания конкурентных магнитных шариков ConA | Клетки, оставшиеся после связывания YEASEN Магнитные бусины ConA |
Рис. 6.Изображение клеток, связанных с магнитными шариками ConA
(3) Число и повторяемость связывания клеток
Оба 10 мкл YEASEN Бусины ConA (Cat#19810) и 10 мкл бусины ConA конкурента связывают количество клеток на уровне E7, сопоставимое с конкурентом. Захват клеток составил >90% при повторных операциях.
Рис 7. Результаты количество клеток, связывающих шарики ConA, и скорость захвата
(4)Устойчивость при ускорении
Распределить по 1 мл/пробирку. Условия хранения были следующими: 4℃, 37℃ ускоренная обработка в течение 2, 4, 7, 11 и 14 дней и -20℃ деструктивная обработка в течение 1, 3, 6 и 8 дней. Результаты показали, что при тех же экспериментальных условиях: скорость захвата клеток продуктами, хранящимися при 4℃, ускоренной обработке при 37℃ и деструктивной обработке при -20℃, составила >95%, а значение CV трех групп репликатов при каждом условии обработки было в пределах 1%, что показало хорошую воспроизводимость.
Рис 8. Результаты скорости захвата клеток и смещения повторяемости гранул ConA при различной температуре и времени
Информация о заказе
| 19810ES |