Yeasen и Molefuture разработали термотолерантную, высокую верность ДНК -лигазу T4 для борьбы с ложным лигированием

Yeasen и Molefuture представляют усовершенствованную ДНК-лигазу T4 для решения проблем молекулярной биологии

Yeasen и Molefuture совместно разработали передовую ДНК-лигазу T4 с использованием своей платформы ZymeEditor, решая ключевые проблемы молекулярной биологии и создания библиотек ДНК для секвенирования следующего поколения (NGS). Традиционная ДНК-лигаза T4 сталкивается с такими проблемами, как низкая стабильность, высокое образование димеров адаптеров и высокая степень самолигирования фрагментов ДНК. Этот новый фермент призван преодолеть эти ограничения.

ДНК-лигаза T4, АТФ-зависимый фермент, имеет компактно-спиральный домен связывания ДНК (DBD), домен нуклеотидилтрансферазы (NTase) и домен OB-fold. Анализируя структуру белка, исследователи определили ключевые остатки в пределах от 5 до 20 Å от субстрата ДНК. Используя передовые вычислительные инструменты, скрининг in silico и структурно-функциональный анализ, они разработали мутанты посредством выравнивания консенсусной последовательности, включив структурно-функциональные идеи.

В дополнение к рациональному дизайну команда использовала метод MTPS для направленной эволюции, проведя скрининг более 10 000 мутантов на стабильность, активность и остаточную активность. Перспективные кандидаты прошли строгую очистку и тестирование. Затем последовала подробная характеристика, оценивающая активность, стабильность, самолигирование адаптера, самолигирование фрагмента ДНК и выход ДНК.

Исследователи объединили рациональный дизайн ДНК и направленную мутацию на мутантах G1, чтобы разработать исключительные варианты, подходящие для разнообразных приложений. Этот комплексный подход привел к созданию высокоэффективной и надежной ДНК-лигазы T4, которая готова улучшить исследования в области молекулярной биологии и создание библиотеки ДНК в NGS.