Адаптер NGS, неотъемлемая часть библиотеки секвенирования следующего поколения, играет роль в соединении тестируемого фрагмента ДНК и ячейки Flow (чипа секвенирования). Эффективность соединения является важным фактором, определяющим качество и выход библиотеки. Так что же такое адаптер NGS? Каковы распространенные типы адаптеров NGS? И как выбрать правильные адаптеры NGS для ваших платформ секвенирования?

1. Что такое адаптер NGS?

2. Какие факторы следует учитывать при выборе индекса NGS?

3. Каковы распространенные типы индексов?

4. Каковы распространенные типы адаптеров NGS?

• UMI-адаптер
• Полные адаптеры
• Неполные адаптеры
• Адаптеры Tn5

5. Как выбрать правильные адаптеры NGS для ваших платформ секвенирования?

6. Относительно чтения

1. Что такое адаптер NGS?

Адаптер NGS, серия адаптеров в секвенировании, представляет собой короткую нуклеотидную последовательность с известной последовательностью. Он лигируется с обоими концами целевого фрагмента нуклеиновой кислоты. Во время секвенирования он начинает секвенирование путем гибридизации с известной последовательностью на ячейке Flow для объединения библиотеки с чипом. Так какова же структура адаптера NGS?

На примере платформы Illumina адаптер NGS можно разделить на три части:

P5 и P7: последовательность, объединенная с концами P5 и P7 на проточной ячейке, фиксирует библиотеку на чипе секвенирования, облегчая кластерную реакцию посредством мостовой ПЦР.

Rd1 SP и Rd2 SP (праймер секвенирования Read1/Read2): области связывания праймеров секвенирования, указывающие положение, в котором начинается считывание последовательности.

Индекс (также известный как штрих-код): известная синтетическая последовательность, используемая для различения различных образцов при секвенировании смешанной библиотеки.

Инжир. 1 Библиотека единого индекса платформы Illumina

Инжир. 2 Библиотека индексов одностороннего доступа платформы MGI

С ростом пропускной способности секвенирования можно секвенировать несколько образцов одновременно. Поэтому особенно важно различать разные образцы. Как упоминалось ранее, индексные последовательности адаптера NGS используются для дифференциации различных образцов в секвенировании следующего поколения (NGS). Какие факторы следует учитывать при выборе индекса? Пожалуйста, продолжайте читать...

2. Какие факторы следует учитывать при выборе индекса?

Индекс обычно имеет длину 6nt-18nt и делится на одинарный индекс и двойной индекс в соответствии с количеством индексов. Двойной индекс располагается на обоих концах фрагмента, который должен быть протестирован. При выборе комбинации индексов следует учитывать баланс основания и баланс флуоресценции.

Базовый баланс относится к балансу между несколькими индексами, а не к базовому балансу в одном индексе. Его необходимо учитывать как с точки зрения базовых типов, так и с точки зрения базового распределения. Принцип объединения заключается в том, что необходимо включить четыре базы A/T/C/G в одну и ту же группу индексов, причем доля этих четырех баз близка и составляет около 25% соответственно.

Баланс флуоресцентного сигнала относится к выбору для обеспечения баланса флуоресцентных сигналов, когда базовый баланс не может быть гарантирован. В 4-канальном секвенаторе на платформе Illumina dG/dT помечен зеленой флуоресценцией, а dC/dA помечен красной флуоресценцией. Во время секвенирования в каждом цикле должны присутствовать как зеленые, так и красные флуоресцентные сигналы, чтобы гарантировать успешное секвенирование. Поэтому при выборе индекса следует учитывать баланс между зеленым и красным сигналами.

3. Каковы распространенные типы индексов?

К распространенным двойным индексам обычно относятся уникальный двойной индекс (UDI), уникальный двойной штрихкод (UDB) и комбинированный двойной индекс (CDI), которые значительно сокращают количество скачков индекса и ошибок в его назначении.

UDI&UDB: индексы на обоих концах соответствуют друг другу, спроектированы группами и могут быть перекрёстно проверены на обоих концах;

Набор праймеров Stubby UDI для Illumina, поставляемый Yeasen (каталожный номер 12404ES/12405ES)>>

CDI: индексы на обоих концах могут быть объединены в соответствии с определенными требованиями для формирования двусторонней библиотеки индексов;

Праймер CDI 384 для Illumina, набор 1-2, поставляемый Yeasen (каталожный номер12412ES/12413ES)>>

Для повышения производительности и эффективности амплификации, а также снижения стоимости секвенирования компания Illumina внедрила технологию кластеризации с использованием проточной ячейки матрицы (PFCT) и эксклюзивной амплификации (ExAmp) для Novaseq и других высокопроизводительных секвенаторов, но непреднамеренно усилила явление несоответствия меток образцов и скачков индекса.

Рис. 3. Различные модели приборов Illumina используют нешаблонированную или шаблонизированную проточную ячейку.

Чтобы компенсировать проблему индексного перескока, выявленную такими платформами секвенирования, как HiSeq3000/4000, HiSeq X Series и NovaSeq, Illumina предложила стратегию размещения индекса на обоих концах библиотеки, что может выполнять двустороннюю проверку и устранять несоответствующие адаптеры. При использовании уникальных индексов на обоих концах частота распределения ошибок индекса будет снижена до 0,01%. По сравнению с предыдущим традиционным методом комбинирования групп перестановок индексов перескоки индексов будут сокращены на два порядка.

При построении библиотеки без ПЦР доступен одноконцевой индексный адаптер. Несовпадение меток в основном вызвано ошибками секвенирования. В целом, уровень несовпадения меток низкий (в среднем 0,0004%, до 0,001%). Однако при построении целевой библиотеки захвата проблема перекрестных помех усиливается, поскольку несколько шагов приведут к несовпадению меток, и обычно используются адаптеры UDI/UDB/CDI.

4.Каковы распространенные типы адаптеров NGS?

С развитием технологии секвенирования появляется все больше и больше типов адаптеров, таких как адаптеры с одним индексом/двумя индексами (как упоминалось в разделе 3), адаптеры UMI, адаптеры транспозазы, полные/неполные адаптеры и т. д., которые подходят для различных сценариев применения. В этой части эти адаптеры систематически сортируются, чтобы дать вам основу для выбора адаптера.

4.1 Адаптер UMI

Адаптер уникального молекулярного идентификатора (UMI) — это передовой инструмент для обнаружения низкочастотных мутаций и абсолютной количественной оценки. UMI — это случайная синтетическая последовательность с известной последовательностью. Он может быть разработан как полностью случайная нуклеотидная цепь, частично вырожденная нуклеотидная цепь или фиксированная нуклеотидная цепь.Длина обычно составляет 10 нт (одноконцевой UMI) или 5-8 нт (двухконцевой UMI). Его функция заключается в замораживании состояния фрагментов ДНК перед амплификацией, и каждая молекула ДНК соответствует UMI. Поэтому во время анализа биоинформатики он может различать шаблоны ДНК из разных источников, отличать ложноположительные мутации, вызванные случайными ошибками в процессе амплификации и секвенирования ПЦР, от тех, которые на самом деле являются носителями пациентов, чтобы отфильтровать фоновый шум, реализовать точное обнаружение низкочастотных и крайне низкочастотных мутаций и провести абсолютную количественную оценку различных молекул ДНК. Он широко используется для обнаружения низкочастотных мутаций, особенно в области исследования опухолей.

Рис. 4 Принципиальная схема адаптера UMI структура платформы Illumina

4.2 Полные адаптеры

Полные адаптеры, необходимый продукт для библиотеки без ПЦР, содержат все последовательности, необходимые для секвенирования, такие как P5, P7, RdS1 и RdS2 на платформе Illumina, а также индексируют последовательности и последовательности UMI в соответствии с требованиями к секвенированию. С полными адаптерами секвенирование может быть выполнено напрямую без введения других адаптеров через ПЦР. Таким образом, полные адаптеры могут использоваться для создания библиотеки без ПЦР. Библиотеки без ПЦР могут снизить смещение амплификации ПЦР, частоту ошибок и дублирование последовательностей, увеличивая охват некоторых областей с высоким GC или высоким AT, которые широко используются в исследованиях популяционного генома.

Полный комплект адаптера для платформы Illumina, поставляемый Yeasen (Cat#13519ES/13520ES)>>

Полный комплект адаптера для платформы MGI, поставляемый Yeasen (Cat#13360ES/13361ES)>>

Рис. 5 Полная схема адаптера

4.3 Неполные адаптеры

Неполные адаптеры должны вводить другие последовательности с помощью ПЦР после лигирования адаптера, чтобы сформировать полный адаптер. Они характеризуются высокой эффективностью соединения и высокой эффективной скоростью библиотеки. Процесс ПЦР является эффектом обогащения для полной библиотеки, чтобы гарантировать концентрацию эффективной библиотеки, а также может вводить двусторонние индексы и последовательности UMI.

4.4 Адаптеры Tn5

Адаптеры Tn5 соединяют часть последовательности адаптера с обоими концами фрагментов ДНК посредством активности эндонуклеазы рестрикции Tn5. Они делают фрагментацию и лигирование адаптера выполняемыми одновременно, чтобы сэкономить время и образцы. Наконец, остальная часть последовательности линкера, индекс, UMI и другие последовательности вводятся с помощью ПЦР для формирования полной библиотеки. Его можно использовать для построения библиотеки Cut&tag.

Рис.6 Принципиальная схема построения библиотеки адаптера Tn5

5. Как выбрать правильные адаптеры NGS для ваших платформ секвенирования?

В настоящее время существуют две основные платформы секвенирования, включая Illumina и MGI. Yeasen, поставщик комплексного решения для NGS, разработал несколько адаптеров NGS, подходящих для платформ Illumina или MGI.

Что касается платформы Illumina, адаптеры Illumina NGS, поставляемые Yeasen, содержат три типа, включая UDI, CDI и один индекс. Что касается платформы MGI, адаптеры MGI NGS, предлагаемые Yeasen, содержат два типа, включая Dual UMI-UDB и единый индекс.В следующей таблице мы привели информацию о продукте, включая типы адаптеров, доступные размеры и концентрацию адаптера и праймера соответственно.

Адаптеры Complete и UDI NGS не требуют проблем со сцеплением, подходят для клиентов, которым нужна простота использования; адаптеры CDI NGS имеют меньше трубок и небольшой размер, что подходит для клиентов, которым нужно удобство хранения и переноски. Для PCR-free требуются полные адаптеры NGS.

Для Иллюмины

InTube	Хайфф NGS® ДПодготовка к либерализации в Северной Америке 384 CDI Primer для Illumina, набор 1 (8*12, индекс 96)	12412ES
	Хайфф NGS® ДПодготовка к либерализации в Северной Америке 384 CDI Primer для Illumina, набор 2 (8*12, индекс 96)	12413ES
	Праймер Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI для Illumina, набор 1 (индекс 96)	12414ES
	Праймер Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI для Illumina, набор 1 (индекс 96)	12415ES
В пластине	Набор праймеров Hieff NGS® Stubby UDI для Illumina (индекс 1-384), набор 1-4	12407ES
	Набор грунтовок Hieff NGS® Stubby UDI для Illumina Набор1（96-луночный планшет, индекс 1-96） Набор 1	12327ES
	Набор грунтовок Hieff NGS® Stubby UDI для Illumina Набор2（96-луночный планшет, индекс 97-192） Набор 2	12328ES
	Набор грунтовок Hieff NGS® Stubby UDI для Illumina Набор3（96-луночный планшет, индекс 193-288） Набор 3	12329ES
	Набор грунтовок Hieff NGS® Stubby UDI для Illumina Набор4（96-луночный планшет, индекс 289-384） Набор 4	12330ES

Относительно чтения

Ключевые ферменты, участвующие в построении библиотеки NGS

Насколько хорошо вы разбираетесь в технологиях, связанных с NGS?

Различные типы магнитных частиц в NGS: ДНК\РНК\мРНК магнитные частицы

Количественная оценка библиотеки NGS: быстрый и точный кубит или точная ПЦР? Все, что нужно!