Различные типы магнитных частиц в NGS: ДНК\РНК\мРНК магнитные частицы
Магнитные бусины являются одним из необходимых продуктов в создании высокопроизводительных библиотек секвенирования. Они могут очищать ДНК или РНК, скрининг фрагментов ДНК целевого размера и обогащение целевых нуклеиновых кислот. С развитием технологии секвенирования появились магнитные бусины, специализирующиеся на различных областях применения, включая магнитные бусины для очистки ДНК, магнитные бусины для выбора размера ДНК, магнитные бусины для очистки РНК и магнитные бусины для обогащения мРНК. Так в чем же принцип действия различных магнитных бусин? Как выбрать?
Запросите бесплатный образец и более низкую цену при оптовой закупке
1. ДНК-бусины
2. Знакомство с бусинами ДНК Star
3. Гранулы для очистки РНК
4. Магнитные шарики, обогащенные мРНК
5. Рекомендации по использованию магнитных бусин Yeasen
1. ДНК Бусины
1.1 Основные принципы
Принцип очистки нуклеиновой кислоты магнитными частицами основан на твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI). При определенных условиях нуклеиновая кислота селективно связывается с магнитными частицами, в то время как загрязняющие вещества остаются в растворе. После приложения магнитного поля магнитные частицы, связывающиеся с целевыми молекулами, отделяются от раствора, а затем магнитные частицы очищаются для дальнейшего удаления загрязняющих веществ. Поскольку сочетание магнитных частиц и молекул нуклеиновой кислоты является обратимым, нуклеиновую кислоту можно элюировать из магнитных частиц буфером с низким содержанием соли.
Внешняя поверхность магнитных шариков модифицирована кремниевыми гидроксильными или карбоксильными функциональными группами. В системе буфера очистки, содержащей ПЭГ и ионы высокой соли, ДНК связывается с шариками, образуя ионный мостик из карбоксильной группы иона соли ДНК. Это связывание обратимо. Ионный мостик удаляется в буфере TE без ПЭГ и ионов соли, и, наконец, ДНК очищается. На основе карбоксильных магнитных шариков различные входы магнитных шариков и буферы очистки будут связывать фрагменты разного размера. Магнитные шарики предпочтительно связывают большие фрагменты ДНК, поэтому в первом раунде магнитные шарики используются для связывания фрагментов, больших, чем целевой фрагмент, и супернатант сохраняется; Во втором раунде магнитные шарики связывают целевой фрагмент в супернатанте, а затем отбрасывают супернатант; Наконец, целевой фрагмент элюируется из магнитных шариков, в которых фрагменты ДНК имеют целевой размер.
Рисунок 1. Структура магнитной бусины карбоксила
Рисунок 2. Принцип очистки ДНК магнитными частицами
1.2 Процесс операции
Рисунок 3. Этапы очистки ДНК
Рисунок 4. Этапы выбора размера ДНК
1.3 Советы по использованию магнитных бусин
Улучшенный выход и точный выбор размера
(1) Тщательно перемешайте перед использованием и уравновесьте. магнитные шарики при комнатной температуре не менее чем на 30 минут.
——Растворимость ПЭГ в магнитных шариках Буфер легко поддается влиянию pH и температуры.Перед применением необходимо провести выравнивание до комнатной температуры, чтобы сделать магнитные шарики равномерно суспендированы, а ПЭГ полностью растворен, что позволяет избежать влияния на эффекты адсорбции и разделения
(2) Время адсорбции должно быть достаточным, а смесь полностью перемешана. сделать адсорбцию адекватной;
(3) Промывание 80% этанолом во время очистки или разделения;
——Под 80% этанолом нуклеиновая кислота дегидратируется и собирается плотно, и не растворяется. Остаточные ферменты, буферы, примеси и т. д. в системе очищаются этанолом для получения более чистого библиотека.
(4) При выборе размера подтвердите объем образца, чтобы убедиться в правильности соотношения добавления магнитных частиц;
——При выборе размера необходимо точно ввести соответствующий объем магнитных частиц, чтобы пропорция была точной, поскольку изменение концентрации ПЭГ и солевых ионов в буфере может повлиять на результаты.
(5) Перед этапом элюирования дайте спирту полностью испариться, но предотвратить бусины от пересушивание
——Обычно его можно высушить за 2~3 мин. Когда количество магнитных шариков большое и их трудно высушить, Рекомендуется работать с несколькими центрифужными пробирками.
(6) Если магнитные частицы агломерированы или слоистые, время элюирования может быть продлен после полного перемешивания;
——Это может быть вызвано примеси в ДНК или слишком долгое время сушки. Обычно, когда в ДНК много примесей, рекомендуется сначала очистить ее до выбор размера.
2. Введение в звездные ДНК-бусины
Бисеры для отбора ДНК Hieff NGS™ основаны на принципе SPRI (твердофазная обратная иммобилизация), с использованием импортного сырья магнитных бисерных материалов и оптимизированной буферной системы, которая может использоваться для отбора и очистки размера фрагментов ДНК во время построения библиотеки NGS. Он используется таким же образом, как и используемые бисерины AMPure XP, а эффективность восстановления фрагментов и распределение размера библиотеки в высокой степени соответствуют им.
2.1 Введение в эффективность очистки
- Уникальная буферная система: фрагменты ДНК вплоть до 50bp можно восстановить.
- Высокий процент восстановления: ≥90%.
- Эффективное удаление примесей: эффективное удаление примесей, таких как димер праймера, dNTP, неорганические соли и белки.
- Широкий спектр применения: подходит для очистки ДНК в таких сценариях, как ферментативное расщепление, лигирование, клонирование и создание библиотеки NGS.
Таблица 1. Эффективность очистки и восстановления ДНК магнитными частицами с различными соотношениями
| Опыт Группы | Концентрация восстановления магнитных частиц в этой партии (нг/мкл) | Скорость восстановления | Группа гранул AMPure XP (нг/мкл) ④ | Скорость восстановления | РЕЗЮМЕ% | |||
| Соотношение | ① | ② | ③ | Средний | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96.92% | 22.2 | 94.37% | 2,55% |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82.19% | 17.8 | 75,67% | 6,52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71.42% | 16.2 | 68,87% | 2,55% |
Рисунок 5. Эффект очистки результатов электрофореза в агарозном геле с магнитными частицами
М：лестница ДНК 1 кб;
2.2 Выбор размера производительности
- Легкий к работа: принцип разделения и экспериментальная операция полностью соответствуют магнитным шарикам XP
- Точный выбор размера: размер сортируемых фрагментов точен и стабилен.
- Широкая применимость: подходит для здание Библиотеки ДНК и РНК и адаптация для выбора размера фрагмента различных типов образцов
- Сверхвысокая эффективность затрат: стабильное качество, более экономичная цена, более внимательное предпродажное и послепродажное обслуживание
Рисунок 6. Результаты выбора размера ДНК
3. Гранулы для очистки РНК
Hieff NGS™ RNA cleaner основан на принципе SPRI, который может эффективно удалять белки, ионы солей и другие примеси для получения концентрированных образцов РНК высокой чистоты и тщательно оптимизировать кислотную буферную систему для поддержания стабильности структуры РНК и предотвращения деградации РНК. Он подходит для построения библиотеки РНК, очистки образцов тотальной РНК после удаления рРНК, очистки продуктов РНК, транскрибированных in vitro, очистки продуктов, меченых РНК, очистки синтетической РНК и т. д.
- Высокое качество: импортное сырье, очень стабильное качество
- Оптимизированная буферная система: обеспечивает чистоту и целостность РНК и эффективно предотвращает деградацию РНК
- Высокая эффективность: эффективное восстановление, подходит для создания библиотеки РНК или in vitro восстановление продукта транскрипции и т.д.
Рисунок 7. Электрофореграмма различных образцов после очистки
4. Магнитные шарики, обогащенные мРНК
4.1 Принцип выделения мРНК
Магнитные бусины для разделения и обогащения мРНК — это магнитные бусины, поверхность которых модифицирована олиго (dT). Благодаря принципу гибридизации они могут специфически связывать мРНК с поли-А-хвостом и специфически отделять мРНК от общей РНК или клеток тканей. Этот набор с оптимизированной формулой продукта может эффективно изолировать высокоочищенную полную мРНК из РНК клеток и тканей животных, растений, насекомых и эукариотических микроорганизмов.
Рисунок 8.принцип обогащения и очистки магнитных частиц мРНК
4.2 производительность гранул изоляции мРНК
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit — это независимая разработка Yeasen для выделения мРНК из общей РНК. Бусины для захвата мРНК представляют собой парамагнитные микросферы микронного размера, модифицированные олиго (dT). При объединении с мРНК с поли (A)-хвостом мРНК выделяется и очищается из 10 нг-4 мкг общей РНК с хорошей целостностью.
- Высокая эффективность: очистка мРНК может быть завершена в течение 45 минут.
- Высокая чистота: олиго (dT) магнитные шарики специфически связывают мРНК
- Надежный: полученная мРНК пригодна для NGS, in vitro трансляция, ОТ-ПЦР и синтез кДНК
Рисунок 9. Набор для выделения мРНК. Очистка мРНК из различных образцов РНК.
Примечание: выход генов домашнего хозяйства представляет собой эффект восстановления мРНК. Выход генов, связанных с рРНК характеристика эффективности удаления рРНК
4.3 Часто задаваемые вопросы о магнитных бусинах мРНК
(1) Почему магнитные частицы агломерируются и как эту проблему решить?
——Магнитные бусины Агломерация снизит выход и чистоту мРНК. Образец может содержать много примесей, таких как полисахариды, белки и длинноцепочечные ДНК. Эти примеси приведут к образованию магнитных шариков Агломерация. Решение — продуть магнитные шарики через пипетку. Геномную ДНК можно удалить путем обработки ДНКазой перед очисткой. Если начальный размер образца слишком большой и превышает нагрузку магнитных шариков, магнитные шарики также будут агломерироваться. Рекомендуется работать в соответствии с вводимым количеством, указанным в руководстве.
(2) Почему выход мРНК низкий?
——Существует много причин низкого выхода мРНК:
- Уровень экспрессии мРНК в клетках или тканях низкий, поэтому мы можем выбрать образцы с соответствующим периодом экспрессии или соответствующим образом увеличить общее количество вводимой РНК в образце.
- Соотношение магнитных шариков к образцам слишком низкое, что влияет на комбинацию мРНК и магнитных шариков. Попробуйте увеличить количество магнитных шариков или уменьшить количество и объем вводимой пробы.
- Время гибридизации слишком короткое, время инкубации можно увеличить до 10-15 мин;
- Элюирование недостаточно, необходимо соответствующим образом увеличить объем элюирующего буфера, увеличить время и температуру элюирования или повторить этап элюирования дважды.
(3) Как эффективно устранить рРНК?
——Если операция выполнена неправильно, рРНК будет неспецифически связана с магнитными частицами вместе с мРНК во время очистки, особенно при большом количестве общего поступления РНК. В процессе очистки обычно используют два цикла связывания. эффективно избегать загрязнения рРНК. Убедитесь, что во время эксперимента по промывке смесь полностью перемешана, чтобы удалить неспецифическое связывание и попытаться удалить загрязнение рРНК.
(4) Необходимо ли для многих последующих применений элюировать мРНК и будут ли магнитные частицы мешать последующим ферментативным реакциям?
——Некоторые последующие реакции можно проводить непосредственно с магнитными частицами без элюирования мРНК, например, фрагментацию мРНК и обратную транскрипцию при создании библиотеки РНК.Однако, если необходимо проводить реакции ПЦР, необходимо убедиться, что нет загрязнения геномной ДНК, в противном случае будет сгенерировано много фрагментов геномной амплификации, которые будут мешать экспериментальным результатам. Подробные операции могут быть выполнены в соответствии с инструкциями соответствующих последующих реакций, таких как построение библиотеки RNA-Seq
(5) Может ли набор выделять мРНК непосредственно из клеток или тканей?
——Не рекомендую! Лизат содержит некоторые компоненты, которые повлияют на связывание мРНК. Рекомендуется использовать специальный набор.
5. Рекомендации по использованию магнитных бусин Yeasen
Магнитные шарики серии Hieff NGS™, как и звездные продукты Yeasen, обладают превосходной производительностью и высокой производительностью для удовлетворения различных приложений и легко заменяют шарики Beckman AMPure XP. С момента своего запуска в 2018 году магнитные шарики Yeasen завоевали хорошую репутацию в отрасли, и продажи продолжают расти. Это лучший выбор для хорошего качества и низкой цены.
Таблица 2. Рекомендации по использованию магнитных бусин Yeasen
| Название продукта | Кот# | Спецификация | Сценарии использования и применения |
| Hieff NGS™ Бусины для отбора ДНК | 12601ES03 | 1 мл | 👉ДНК NGS очистка и выбор размера 👉Очистка продукта ПЦР 👉Очистка продуктов ферментативного переваривания и лигирования |
| 12601ES08 | 5 мл | ||
| 12601ES56 | 60 мл | ||
| 12601ES75 | 450 мл | ||
| Hieff NGS™ Очиститель РНК | 12602ES03 | 1 мл | 👉очистка РНК 👉Очистка образцов тотальной РНК после удаления рРНК 👉Очистка РНК-меченых продуктов |
| 12602ES08 | 5 мл | ||
| 12602ES56 | 60 мл | ||
| 12602ES75 | 450 мл | ||
| Мастер-комплект для выделения мРНК Hieff NGS™ | 12603ES24 | 24 Т | 👉Выделение и очистка мРНК 👉Очистка мРНК методом транскрипции in vitro |
| 12603ES96 | 96 Т |
Относительно чтения
Насколько хорошо вы разбираетесь в технологиях, связанных с NGS?
5 минут, чтобы понять прошлое и настоящее ДНК-селекционных гранул (включая анализ результатов и интерпретацию часто задаваемых вопросов)