Количественная оценка нуклеиновых кислот, как один из самых фундаментальных экспериментов в молекулярной биологии, напрямую влияет на результаты последующих экспериментов. Точность количественной оценки нуклеиновых кислот имеет решающее значение. В настоящее время существует два основных метода количественной оценки библиотеки NGS: метод ультрафиолетового поглощения и метод флуоресцентного красителя.

Метод ультрафиолетового поглощения использует спектрофотометр для измерения поглощения при 260 нм для ДНК и РНК для количественной оценки. Он также оценивает чистоту нуклеиновых кислот путем расчета отношения OD260/OD280. Однако обнаруженные значения сильно подвержены помехам от других загрязняющих веществ, таких как свободные нуклеотиды, соли и органические соединения.

Флуориметрический количественный анализ Qubit использует флуоресцентные красители, которые специфически связываются с двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК, РНК или белками. При возбуждении источником света определенной длины волны красители испускают флуоресценцию, на которую не влияют другие примесные молекулы, которые могут присутствовать в образце. Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации целевых молекул в образце.

Таблица 1. Сравнение основных методов количественной оценки нуклеиновых кислот

Цель	УФ-поглощение (нанокапля)	Кубит ДНК HS	Кубит ДНК BR	Кубит РНК	Кубит одноцепочечная ДНК
Тип нуклеиновой кислоты	ДНК, РНК	дцДНК	дцДНК	РНК	одноцепочечная ДНК, олигонуклеотид
Концентрация образца (нг/мкл)	2 нг/мкл-15 мкг/мкл	10 пг/мкл-100 нг/мкл	0,1 нг/мкл-1000 нг/мкл	250 пг/мкл-1000 нг/мкл	50 пг/мкл-200 нг/мкл
Преимущество	Верхний предел количественного определения	Хорошая специфичность	Широкий диапазон количественной оценки	Высокая селективность к РНК	Хорошо переносится
Ограничения	Низкая специфичность	Беречь от света во время использования.	Беречь от света во время использования.	Беречь от света во время использования.	Низкая специфичность, а также связывает двуцепочечную ДНК

УФ-поглощение и флуориметрическое количественное определение Qubit имеют свои преимущества и могут дополнять друг друга. Для предварительной количественной оценки обычных образцов нуклеиновых кислот с целью определения концентрации, чистоты и наличия загрязняющих веществ можно выбрать метод количественной оценки поглощения. Количественная оценка с помощью кубитов больше подходит для низкоконцентрированных ценных образцов или точной количественной оценки, необходимой для последующих экспериментов, таких как секвенирование следующего поколения и количественная ПЦР в реальном времени.

Йесен выпустила несколько продуктов для количественной оценки Qubit: набор для анализа dsDNA HS для Qubit^® (Кат. № 12640), готов к использованию: 1× набор для анализа dsDNA HS для Qubit^® (Кат. № 12642), набор для анализа одноцепочечной ДНК для Кубита^® (№ по каталогу 12645) и набор для анализа dsDNA BR (№ по каталогу 12643), которые получили широкое признание с момента их выпуска.

Решение 1. Высокочувствительная количественная оценка dsDNA HS

Готовая к использованию предварительная смесь для количественного определения dsDNA — 1× набор для анализа dsDNA HS для Qubit^®

^{Простота эксплуатации: готовая к использованию смесь, не требует предварительного смешивания;}

^{Высокая чувствительность: определяемая концентрация составляет всего 50 пг/мкл;}

^{Хорошая стабильность: сигнал флуоресценции сохраняется в течение 3 часов, а хранение при комнатной температуре в течение 20 дней не влияет на точность количественного определения;}

^{A. Превосходная стабильность: хранение при комнатной температуре в течение 2 недель сохраняет стабильность (измеренное значение отклоняется от теоретического менее чем на 10%).}

Таблица 2. Тест стабильности различных образцов при 4°C и комнатной температуре по сравнению с конкурентами

Количественные реагенты	Определенный концентрация λДНК (нг/мкл)
	0д		1д		3д	7д			10д		14д
Т* 4℃	0,51		0,496		0,524	0,534			0,495		0,499
Йесен 4℃	0,51		0,508		0,513	0,475			0,48		0,495
Йесен комнатная температура хранилище	0,51		0,517		0,506	0,486			0,506		0,523
Количественные реагенты	Определенный концентрация геномной ДНК теленка (нг/мкл)
	0д	1д		3д			7д	10д		14д
Т* 4℃	55.3	53,5		55.40			57.9	55,8		58
Йесен 4℃	59.4	55.4		57.8			56.1	56.3		59.8
Йесен комнатная температура хранилище	59	55.7		61.3			58	58.7		56.1

B. Высокая чувствительность, хорошая стабильность от партии к партии

Таблица 3.Тест стабильности различных партий

Бatch	Образец	Л*			Йесен			ошибка
		концентрация1 (нг/мкл)	концентрация2 (нг/мкл)	СРЕДНЕЕ (нг/мкл)	концентрация1 (нг/мкл)	концентрация2 (нг/мкл)	СРЕДНЕЕ (нг/мкл)
Д9801060	λДНК	0,3160	0.3250	0,3205	0.320	0.320	0.320	0,16%
Д8801050		0,3310	0.3320	0,3315	0,319	0,306	0,3125	5.73%
Д7813110		0,345	0,358	0,352	0,334	0,329	0,332	-6.03%

Решение 2. Количественная оценка широкого диапазона dsDNA BR

Количественное определение широкого спектра dsDNA — набор для анализа dsDNA BR

Высокая чувствительность: определяемая концентрация составляет всего 50 пг/мкл;

Отличная линейность: Хорошая линейность в диапазоне 2–1000 нг;

Высокая толерантность к загрязняющим веществам: может переносить обычные загрязняющие вещества.

Таблица 4. Стабильность и устойчивость к загрязняющим веществам по сравнению с конкурентами

Йесен БР						Т* БР
стандартный	РФС1	РФС2	СРЕДНИЙ	ошибка		стандартный	РФС1	РФС2	СРЕДНИЙ	ошибка
С1	159,63	160,71	160.17	1%		С1	216.17	211.56	213.865	-2%
С2	24497.0	25078.64	24787.82	2%		С2	20532.46	20452.26	20492.36	0%
измерение						измерение
Загрязнитель	Концентрация в образце объемом 10 мкл	концентрация1	концентрация2	СРЕДНИЙ	Подлежит тестированию/контролю	Загрязнитель	Концентрация в образце объемом 10 мкл	концентрация1	концентрация2	СРЕДНИЙ	Подлежит тестированию/контролю
Контроль (H)2О)	/	49	48.6	48.8	0.0%	Контроль (H)2О)	/	49.8	48	48.9	0.0%
БСА	1мг/мл	51.8	52	51.9	6.4%	БСА	1мг/мл	54	51.2	52.6	7,6%
этанол	20%	44,6	44	44.3	-9,2%	этанол	20%	44,8	43.4	44.1	-9,8%
хлороформ	4.00%	49.0	49.8	49.4	1,2%	хлороформ	4.00%	50.0	47	48,5	-0,8%
СДС	0,2%	46.6	45.8	46.2	-5,3%	СДС	0,2%	53.2	51.6	52.4	7.2%
Тритион-X100	0,20%	41.6	40.6	41.1	-15,8%	Тритион-X100	0.20%	53	51	52.0	6.3%
dNTP	2мМ	44.2	45	44,6	-8,6%	dNTP	2мМ	47.8	46.4	47.1	-3,7%

Решение 3. Количественная оценка одноцепочечной ДНК

Идеальный выбор для количественного определения одноцепочечной ДНК — высокопроизводительный набор для анализа одноцепочечной ДНК для Qubit^®

^{Высокая чувствительность: определяемая концентрация составляет всего 50 пг/мкл;
Отличная линейность: Хорошая линейность в диапазоне 0-200 нг;
Стабильный сигнал: превосходный краситель в сочетании с улучшенным оптимизированным буфером может поддерживать стабильную интенсивность флуоресценции при комнатной температуре и отлично подходит даже для обычных загрязненных сред, таких как соли, свободные нуклеотиды, растворители, моющие средства или белки, что гарантирует точную количественную оценку;
Хорошая стабильность: никаких существенных изменений характеристик после 6 месяцев обработки при 4°C или 25°C;
Широкий спектр применения: простой рабочий процесс, позволяющий быстро проводить количественную оценку олигонуклеотидов, праймеров, денатурированной ДНК, одноцепочечной кольцевой ДНК и т. д.}

A. Хорошая повторяемость: Количественное определение на разных приборах Qubit, с использованием разных типов образцов Йесен Протестировано несколько партий Cat#12645. В диапазоне 0-200нг хорошая повторяемость измерений с помощью различных приборов Qubit.