Комплексное руководство по выращиванию органоидов

— Подробная статья, которая углубит ваши знания об органоидах.

Введение в органоиды

Органоиды — это трехмерные структуры с физиологическими функциями, которые имитируют нормальное (или болезненное) состояние внутренних органов или тканей, достигаемое путем 3D-культивирования вне тела. Проще говоря, органоиды — это трехмерные клеточные культуры, в которых стволовые клетки культивируются в матричном геле. Под воздействием химических ингибиторов/активаторов, цитокинов и культуральных добавок органоиды развиваются в тканевые структуры, подобные соответствующим органам.

Характеристики органоидов

Органоиды обладают способностью к самообновлению, сохраняя физиологическую структуру и функцию исходной ткани. Их часто называют «микроорганами в чашке». Используя способности стволовых клеток к самообновлению, дифференциации и самоорганизации, органоиды могут быть криоконсервированы для использования в биобанках и могут подвергаться неограниченному расширению. Органоиды очень сложны и, по сравнению с двумерными клетками, больше напоминают состояние in vivo.

Рисунок 1. Органоидное культивирование клеток аденокарциномы толстой кишки человека [1]

Применение органоидов

Отличительной чертой органоидов является их способность лучше имитировать среду in vivo, что делает их подходящими для молекулярного и клеточного биологического анализа. Сокращая разрыв между животными и клеточными уровнями, органоиды предлагают превосходное решение для исследований в таких областях, как изучение опухолей, скрининг лекарственных средств, регенеративная медицина и т. д. Они широко применяются в функциональной индукции тканей, создании моделей заболеваний, скрининге лекарственных средств, противовоспалительных тестах, клинических исследованиях и различных других исследовательских аспектах, демонстрируя большой потенциал как в фундаментальных исследованиях, так и в трансляционных приложениях.

Поскольку системы культивирования органоидов и экспериментальные методы продолжают развиваться, органоиды стали использоваться для различных тканей и органов, включая кишечник (тонкий кишечник/толстая кишка), желудок, печень, сердце, легкие, простату, поджелудочную железу, почки, грудь, мозгоподобные структуры, сетчатку, внутреннее ухо и многое другое.

Органоиды, полученные из опухолевых стволовых клеток, продемонстрировали значительный потенциал в понимании механизмов возникновения и развития опухолей, скрининге чувствительности к препаратам и продвижении точной медицины и персонализированной диагностики. Многочисленные статьи из Cell and Science указывают на то, что органоиды демонстрируют высокую чувствительность и специфичность в прогнозировании эффективности противораковых препаратов. Недавно опухолевые органоиды продемонстрировали свою роль в прогнозировании реакции пациентов на противораковые препараты и содействии в разработке персонализированных планов лечения.

Исследование механизмов развития: Возможности дифференциации органоидов делают их пригодными для изучения процессов и механизмов эмбрионального развития. Процессы индукции, регулируемые сигнальными путями, такими как Wnt и BMP, могут быть использованы для изучения развития таких органов, как мозг, поджелудочная железа и желудок [2][3][4].

Установление моделей повреждений при заболеваниях: органоиды, полученные из определенных тканей или органов, можно использовать для изучения моделей определенных заболеваний. Группы под руководством Чжао Бина и Линь Синьхуа использовали модели инфекций человеческих органоидов для изучения молекулярных механизмов заражения SARS-CoV-2 и повреждения печени, предоставляя важные инструменты для исследования патогенных механизмов вируса и последующей разработки лекарств [5]. Исследовательская группа под руководством Дэн Хункуя в Школе естественных наук Пекинского университета использовала малые молекулы и цитокины для стимуляции создания нового кишечного органоида с функциями регенерации повреждений — гиперорганоида.Этот органоид можно пассировать и амплифицировать в течение длительного периода, сохраняя геном и способствуя восстановлению поврежденных тканей толстой кишки, облегчая патологические симптомы в модели острого колита у животных и многое другое [6].

Регенеративная медицина: органоиды, полученные из стволовых клеток, могут восстанавливать или заменять поврежденные или больные ткани для восстановления нормальной функции тканей. Они широко применяются в клеточной терапии, в том числе при других нейродегенеративных заболеваниях, диабете, сердечно-сосудистых заболеваниях, расстройствах сетчатки, травмах спинного мозга и многом другом. Как новый метод лечения в области регенеративной медицины — DA01, использующий такие малые молекулы, как SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 и белок Sonic Hedgehog (Shh), стимулирует плюрипотентные стволовые клетки к дифференциации в дофаминергические нейроны. Затем эти нейроны трансплантируются в поврежденные области мозга пациентов с болезнью Паркинсона на поздней стадии, обеспечивая новое направление и подход к лечению этого заболевания [7].

Тестирование токсичности и эффективности лекарств: органоиды могут использоваться для проверки фармакотоксичности новых лекарств в определенных органах или тканях, предоставляя данные для поддержки разработки новых лекарств. Примером может служить использование органоидов почек Хаймана для проверки почечной токсичности цисплатина [8].

Скрининг лекарств: Органоиды, полученные из стволовых клеток, могут использоваться для in vitro тестирования лекарственных реакций, обеспечивая теоретическую поддержку скрининга лекарств. Органоиды толстой кишки могут использоваться для изучения планов лечения пациентов с мутациями CFTR, а опухолевые органоиды могут использоваться для оценки индивидуальных ситуаций с приемом лекарств для пациентов [9].

История развития органоидов

Источники органоидов

Нормальные органоиды в основном происходят из стволовых клеток, включая плюрипотентные стволовые клетки (PSC) и взрослые стволовые клетки (ASC). Плюрипотентные стволовые клетки включают эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). По сравнению с плюрипотентными стволовыми клетками, взрослые стволовые клетки имеют преимущество в том, что их проще и быстрее моделировать, но недостаток в том, что они создают относительно более простые органоидные структуры. Органоидные структуры, построенные из плюрипотентных стволовых клеток, более сложны.

Продукция, используемая в Выращивание органоидов

Часто используемые малые молекулы в культуре органоидов (краткое изложение): Очень практично, не забудьте добавить в закладки!

❶ Y-27632 (кат. № 53006ES, кат. № 52604ES): мощный ингибитор Rock, конкурентно ингибирующий p160ROCK (Ki = 140 нМ) и ROCK-II (IC50 = 800 нМ) за счет конкуренции с АТФ.Он также ингибирует PRK2 (IC50=600 нМ). Обычно добавляется во время первого посева в культуру пластины; последующие изменения среды могут не требовать добавления. Обработка человеческих эмбриональных стволовых клеток Y-27632 (10 мкМ) в течение 1 ч может ингибировать апоптоз, повышать эффективность клонирования и продлевать клеточные пассажи.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 10 мкМ.

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): эффективный ингибитор p38 MAPK киназы, нацеленный на p38α/β. SB202190 может индуцировать дифференциацию человеческих эмбриональных стволовых клеток в клетки сердечной мышцы, способствовать самообновлению нейральных стволовых клеток и применим к культуре желудочно-кишечных и молочных желез органоидов.

Рекомендуемая концентрация растворения: растворите 10 мг в 3,018 мл ДМСО для получения 10 мМ раствора; храните при температуре -20 ℃.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 10 мкМ.

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): производное аминопиримидина, действующее как ингибитор GSK-3 (GSK3α/β). Он индуцирует дифференциацию человеческих эмбриональных стволовых клеток в энтодерму и используется в культурах органоидов почек и сетчатки. CHIR-99021, при использовании в сочетании с другими реагентами, стимулирует перепрограммирование соматических клеток в стволовые клетки.

Рекомендуемая концентрация растворения: растворите 5 мг в 3,58 мл ДМСО для получения 3 мМ раствора; храните при температуре -20 ℃.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 3 мкМ.

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): ингибитор пути Activin/NODAL/TGF-β, ингибирующий активность киназы ALK5/4/7. Обычно используется в культуре органоидов печени, простаты и молочной железы. Обычно используется для ингибирования дифференциации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и поддержания самообновления клеток in vitro.

Рекомендуемая концентрация растворения: Растворите 5 мг в 5,93 мл ДМСО для получения 2 мМ раствора; храните при температуре -20 ℃. (Примечание: этот продукт нестабилен в растворе и рекомендуется для немедленного использования после приготовления.)

Рекомендуемая рабочая концентрация: 2 мкМ.

❺ Гастрин I (Cat#53007ES): Гастрин — эндогенный желудочно-кишечный пептидный гормон, который стимулирует клетки стенки желудка к секреции желудочной кислоты. Он имеет решающее значение для исследований желудочно-кишечных органоидов. При культивировании кишечных и печеночных органоидов добавление гастрина помогает продлить время выживания органоидов.

Рекомендуемая концентрация растворения: растворите 1 мг в 2,38 мл 1% раствора аммиака для получения 0,2 мМ раствора; хранить при температуре -20 ℃.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 10 нМ.

❻ Никотинамид (Cat#51402ES): Никотинамид, витамин B3, участвует в различных ферментативных окислительно-восстановительных реакциях и используется в культуре органоидов желудочно-кишечного тракта, печени и молочной железы. Никотинамид в сочетании с цитокинами и другими биохимическими реагентами проявляет противовоспалительные свойства, способствует дифференциации мезенхимальных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки, подавляет активность сиртуинов и используется для содействия формированию органоидов и продления срока их службы.

Рекомендуемая концентрация растворения: растворите 100 мг в 8,19 мл H2O (или ДМСО) для получения 100 мМ раствора; хранить при температуре -20 ℃.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 10 мМ.

❼ Форсколин (Cat#51001ES): Форсколин может активировать аденилатциклазу, обычно используемую для повышения внутриклеточного уровня цАМФ. Форсколин вызывает дифференциацию различных типов клеток, активирует PXR и FXR, а также обладает антиагрегационным и антигипертензивным эффектами. При культивировании печеночных органоидов необходимо добавлять это вещество.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 1-10 мкМ.

❽ Простагландин E2 (Cat#60810ES): Простагландин E2 (PGE2) регулирует многие физиологические системы, опосредуя пролиферацию и дифференцировку клеток.Он необходим при культивировании органоидов печени и простаты и связан с расслаблением гладких мышц, воспалением, репродукцией, регуляцией цикла сна и целостностью слизистой оболочки желудка.

Рекомендуемая концентрация растворения: растворите 1 мг в 0,28 мл ДМСО для получения 10 мМ раствора; храните при температуре -20 ℃.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 500 нМ.

❾ N-ацетил-L-цистеин (Cat#50303ES): N-ацетил-L-цистеин (NAC) является предшественником антиоксиданта глутатиона с антиоксидантным и ингибирующим ROS эффектами. Он ингибирует апоптоз нейрональных клеток и требуется в процессе культивирования большинства органоидов.

Рекомендуемая концентрация растворения: растворите 2 г в 24,51 мл H2O (или ДМСО) для получения 500 мМ раствора; хранить при температуре -20 ℃.

Рекомендуемая рабочая концентрация: 1 мМ.

Сопутствующая информация о продукте

Ссылки：

[1] Сато Т., Стэнге Д.Э. и др.Длительное расширение эпителиальных органоидов из толстой кишки человека, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта. Гастроэнтерология. 2011 ноябрь;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2 сентября 2011 г. PMID: 21889923.

[2] Ланкастер МА, Реннер М и др. Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Nature. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Греджио С. и др. Искусственные трехмерные ниши разрушают развитие поджелудочной железы in vitro. Развитие. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] Маккракен К. В. и др. Моделирование развития и заболеваний человека в желудочных органоидах, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Чжао Б., Ни К. и др. Повторение инфекции SARS-CoV-2 и повреждения холангиоцитов с помощью протоковых органоидов печени человека. Protein Cell. 2020 октябрь;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Цюй М., Сюн Л. и др. Создание культур кишечных органоидов, моделирующих регенерацию эпителия, связанную с травмой. Cell Res. 2021 март;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 янв. 8. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics объявляет о первом пациенте, которому была введена доза DA01 в исследовании фазы 1 у пациентов с прогрессирующей болезнью Паркинсона. Пресс-релиз BlueRock Therapeutics: 8 июня 2021 г.

[8] Takasato M, Er PX и др. Органоиды почек из человеческих iPS-клеток содержат множественные линии и моделируют человеческий нефрогенез. Nature. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Спенс Дж. Р., Мейхью К. Н. и др. Направленная дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток в кишечную ткань in vitro. Природа. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.