Центр оценки лекарственных средств (CDE) Национального управления по контролю за продуктами медицинского назначения четко указал в своих рекомендациях по продуктам генной терапии, что необходимо контролировать количество остатков ДНК и размер остаточных фрагментов, рекомендуя контролировать размер остаточных фрагментов ДНК ниже 200 п.н., насколько это возможно. Поэтому удаление остаточных нуклеиновых кислот из биофармацевтических препаратов чрезвычайно важно. С ростом сложности производственных процессов эффективное удаление остаточных нуклеиновых кислот в средах с высоким содержанием соли сталкивается с многочисленными новыми проблемами:
- В процессе очистки вирусов AAV для улучшения восстановления вируса часто используют буферы с более высокой концентрацией соли (200-500 мМ). Однако обычные нуклеазы показывают значительное снижение активности с увеличением концентрации соли. Если эффект очистки должен быть улучшен за счет увеличения количества фермента и времени инкубации, это значительно увеличит затраты
- ДНК хозяина обычно существует в форме хроматина и легко инкапсулируется белками, что делает ДНК недоступной. В высокосоленой среде нуклеиновые кислоты и белки могут эффективно разделяться, тем самым лучше удаляя остаточные нуклеиновые кислоты
- Вирусные векторы, такие как AAV, могут агрегировать из-за электростатических взаимодействий, и эта агрегация с большей вероятностью происходит в условиях низкой ионной силы и остаточной ДНК, что приводит к снижению стабильности и влияет на выход. Увеличение концентрации соли может эффективно снизить агрегацию частиц вируса AAV, улучшая скорость восстановления частиц вируса AAV
Salt Active UltraNuclease (солеустойчивая нуклеаза широкого спектра действия) — рекомбинантная неспецифическая эндонуклеаза, полученная из морских микроорганизмов. По сравнению с UltraNuclease она проявляет оптимальную активность при концентрации соли 500 мМ и может эффективно удалять загрязнения нуклеиновыми кислотами даже в средах с высоким содержанием соли.
Сценарии применения продукта
- Удаление остаточных нуклеиновых кислот в биопрепаратах: в процессе производства биопрепаратов, таких как вирусы, вакцины и белки, можно добавлять UltraNuclease для разрушения остаточных нуклеиновых кислот. Этот шаг не только увеличивает выход вирусов, но и значительно снижает содержание остаточных нуклеиновых кислот, тем самым обеспечивая безопасность и эффективность препаратов.
- Снижение вязкости: за счет деградации нуклеиновых кислот снижается вязкость клеточных лизатов, что облегчает процессы фильтрации/ультрафильтрации во время очистки частиц, полученных из клеток, таких как вирусы, векторы AAV и тельца включения.
- Улучшенное разрешение и восстановление: в анализах ELISA, двумерном электрофорезе и иммуноблоттинге улучшается разрешение и восстановление.
- Предотвращение агрегации клеток: UltraNuclease может эффективно предотвращать агрегацию мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC).
Тестирование производительности продукта
Влияние высокосолевой среды на активность ферментов (Na+)
Чтобы соответствовать использованию Salt Active UltraNuclease, компания Yeasen также самостоятельно разработала специальный набор для обнаружения Соль Активная УльтраНуклеаза, который может эффективно обнаруживать остатки ферментов и снижать риски. Набор Salt Active UltraNuclease ELISA был разработан и произведен в соответствии с руководящими принципами валидации аналитических методов <9101> Китайской фармакопеи 2020 года, строго соблюдая ключевые требования к многопараметрическому тестированию (линейный диапазон, специфичность, точность, прецизионность, чувствительность, ускоренная стабильность и т. д.).
Для этой цели Yeasen Biotech разработала набор ELISA для обнаружения Salt Active UltraNuclease. Набор использует принцип иммуноферментного анализа (ELISA) с двойным сэндвичем антител для обнаружения остаточного количества Salt Active UltraNuclease. Стандартные и тестовые образцы Salt Active UltraNuclease добавляются на планшет с ферментным покрытием, предварительно покрытый антителом anti-Salt Active UltraNuclease (36703-A). Затем добавляется разбавленное биотин-меченое антитело для обнаружения нуклеазы (36703-C), а затем стрептавидин-HRP (SA-HRP) (36703-D). Это образует комплекс антитело + антиген + антитело-биотин + SA-HRP. После промывки планшета добавляется раствор субстрата TMB (36703-H) для проявления цвета. Под действием фермента HRP TMB меняет цвет с бесцветного на синий и, наконец, становится желтым под действием стоп-раствора (36703-I). Интенсивность желтого цвета прямо пропорциональна количеству высокосолеустойчивой универсальной нуклеазы, обнаруженной в образце.
Экспериментальный процесс обнаружения остаточной солевой активной ультрануклеазы с использованием набора Salt Active UltraNuclease ELISA.
Характеристики набора UltraNuclease and Salt Active UltraNuclease ELISA:
Соблюдение нормативных требований: Полностью проверено в соответствии с нормативными требованиями, имеются отчеты о проверке;
Гарантия качества: Все сырье для набора разрабатывается независимо, что обеспечивает контролируемое качество;
Высокая чувствительность: Количественный предел составляет всего 23 пг/мл;
Высокая точность: Высокая внутрипартийная повторяемость и низкая межпартийная изменчивость;
Сильная специфичность: Отсутствие перекрестной реакции с другими сконструированными клеточными белками.
Параметры производительности
| Параметры продукта | содержание |
| Время анализа | 3,5 часа |
| Принцип анализа | Двухцентровой иммуноферментный анализ |
| Усиление сигнала | Система биотин-стрептавидин |
| Длина волны обнаружения | 450 нм и 630 нм |
| Чувствительность | 0,024нг/мл |
| Диапазон обнаружения | 0.047 нг/мл~3 нг/мл |
| Объект обнаружения | Соль Активная УльтраНуклеаза |
| Применимый инструмент | Молекулярные устройства: серии M и i |
| Приложение | Обнаружение остаточной нуклеазы в процессах очистки клеточной и генной терапии и рекомбинантных аденоассоциированных вирусных вакцин |
Данные о продукте:
Стандартная кривая набора реагентов:
Специфичность
Перекрестная реактивность между антителом Salt Active UltraNuclease и семью белками в наборе была оценена с помощью этого набора для обнаружения белков, добавленных в семи процессах. Были установлены положительный контроль (PC-0,047 нг/мл) и отрицательный контроль (NC-0 нг/мл).
Результаты показали, что белок, добавленный в 7 процессах, был близок к отрицательному контролю (NC-0 нг/мл), концентрация обнаружения была ниже предела количественного определения этого набора (0,047 нг/мл), и перекрестной реакции не наблюдалось. наблюдал.
СКоэффициент вылова щуки:
Добавьте три стандарта концентрации (т. е. Std1 3 нг/мл, Std3 0,75 нг/мл и Std5 0,188 нг/мл) в равных пропорциях к двум образцам, предоставленным заказчиком для эксперимента по восстановлению спайка. Результаты показывают, что показатели восстановления спайка находятся в диапазоне от 80% до 120%. Коэффициент восстановления спайка % = (измеренное значение образца с добавкой - измеренное значение образца без добавки) / теоретическое значение (количество добавленного стандарта) * 100%.
| Имя образца | Тестовая концентрация солевой активной ультрануклеазы (нг/мл) | Количество стандарта (нг/мл) | Результат теста (нг/мл) | Скорость восстановления пика (%) |
| ТС1 | 0,04 | 3 | 1.71 | 114.00% |
| 0,75 | 0,347 | 92.53% | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43% | ||
| ТС2 | 0,08 | 3 | 1.772 | 118.13% |
| 0,75 | 0,405 | 108.00% | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64% |
Точность
1) Повторяемость
Для повторных экспериментов были выбраны три стандартных продукта Salt Active UltraNuclease с высокой, средней и низкой концентрацией. В одном и том же эксперименте образцы каждой концентрации были протестированы 10 раз, и CV% < 10%.
| Разница в партии | |||
| Теоретическая концентрация (нг/мл) | Количество повторений | Среднее (нг/мл) | Коэффициент вариации CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2,97% |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2.27% |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56% |
2) Средняя точность
Различные партии наборов использовались для 3 экспериментов, каждый эксперимент проводился с 3 концентрациями: высокой, средней и низкой, и каждая концентрация была повторена 10 раз. Всего было получено 30 данных из каждой точки концентрации, а CV% каждой концентрации был менее 15%.
| Разница в партии | |||
| Теоретическая концентрация (нг/мл) | Количество экспериментов | Среднее (нг/мл) | Коэффициент вариации CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1.423 | 5.70% |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59% |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6.82% |
Информация о продукте
| Название продукта | Продукт число | Технические характеристики продукта |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25КУ/50КУ/100КУ/1МУ/5МУ | |
| 36703ES96 | 96Т |
Другие сопутствующие товары
| Название продукта | Номер продукта | Технические характеристики продукта |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25КУ/50КУ/100КУ/1МУ/5МУ | |
| 36701ES59 | 96Т |