Набор для анализа остаточных фрагментов ДНК клетки-хозяина HEK293 предназначен для Количественный анализ остаточных фрагментов ДНК HEK293 различной длины в промежуточных продуктах, полуфабрикатах и ​​конечных продуктах биологических препаратов. Этот набор использует принцип флуоресцентного зонда qPCR для специфического и быстрого обнаружения остатков ДНК HEK293 как ниже, так и выше 200 пар оснований, с пределом количественного определения всего 10 фг/мкл. Он также включает контроль ДНК HEK293 (количественный эталон ДНК). Этот набор можно использовать вместе с наборами для подготовки образцов остаточной ДНК на основе магнитных шариков (Кат.№18461ES/18462ES).

Информация о продукте

Компонент

Хранение и доставка:

1. Все компоненты поставляются на сухом льду и должны храниться при температуре от -25°C до -15°C после получения. Срок годности составляет 2 года. Компоненты A и B1, B2, B3 и B4 следует хранить в защищенном от света месте.

2. После получения проверьте наличие всех 7 компонентов и немедленно поместите их на хранение при рекомендуемой температуре.

Меры предосторожности:

1. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.

2. В целях безопасности и охраны здоровья во время работы надевайте лабораторные халаты и одноразовые перчатки.

3. Перед использованием этого реагента внимательно прочтите инструкцию. Эксперименты следует проводить, следуя стандартным процедурам, включая обработку образцов, приготовление реакционных смесей и пипетирование.

4. Каждый компонент следует тщательно перемешать путем легкого встряхивания и кратковременного центрифугирования перед использованием.

Совместимые инструменты:

Включая, но не ограничиваясь следующими инструментами: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: Оптический модуль CFX96, Шанхайская медицинская технология Хунши: SLAN-96S

Инструкция по применению

1. Разведение контрольного количественного эталона ДНК HEK293 и подготовка стандартных кривых

Набор для анализа фрагментов HEK293 включает четыре фрагмента амплификации разной длины: 82 п.н., 133 п.н., 227 п.н. и 515 п.н. При построении стандартных кривых установите отдельные кривые для каждого фрагмента амплификации и рассчитайте их остаточные количества и относительное распределение на основе соответствующих стандартных кривых.

Используйте буфер для разбавления ДНК, входящий в комплект, для выполнения градиентного разбавления количественного эталона ДНК HEK293. Концентрации разбавления должны быть: 3 нг/мкл, 300 пг/мкл, 30 пг/мкл, 3 пг/мкл, 300 фг/мкл и 30 фг/мкл.

Подробности следующие:

1). Поместите контроль ДНК HEK293 и буфер для разбавления ДНК из набора на лед для размораживания. После полного размораживания осторожно встряхните для перемешивания и центрифугируйте недолго (10 секунд), чтобы собрать раствор на дне пробирки.

2). Подготовьте шесть чистых центрифужных пробирок объемом 1,5 мл и промаркируйте их как Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 и Std5.

3). В пробирку с маркировкой Std0 добавьте 90 мкл буфера для разбавления ДНК и 10 мкл контроля ДНК HEK293 для достижения концентрации 3 нг/мкл. Аккуратно перемешайте на вортексе и центрифугируйте в течение короткого времени (10 секунд). Эту концентрацию можно разделить на аликвоты и хранить при температуре -20°C для краткосрочного использования (до 3 месяцев). Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.

4). В пробирки с маркировкой Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 и Std5 сначала добавьте по 90 мкл буфера для разбавления ДНК. Каждый этап разбавления следует осторожно перемешать и ненадолго центрифугировать для обеспечения однородности. Затем выполните градиент разбавления следующим образом:

Таблица 1: Стандартное градиентное разбавление

* Для каждой концентрации выполните 3 повтора. Этот реагент может тестировать в линейном диапазоне от 300 пг/мкл до 30 фг/мкл. При необходимости линейный диапазон может быть соответствующим образом расширен или сужен.

** Чтобы сократить количество повторных циклов замораживания-оттаивания и избежать загрязнения, рекомендуется разделить на аликвоты и сохранить количественную пробу ДНК. сстандарт при -20°C для первого использования.

*** Неиспользованный, размороженный раствор ДНК можно хранить при температуре 2-8°C до 7 дней. Если не используется в течение длительного периода, храните его при температуре -20°C.

**** Чтобы обеспечить полное смешивание шаблона, осторожно встряхивайте каждое разбавление градиента в течение примерно 1 минуты.

2. Подготовка тестового образца (TS)

Подготовьте тестовый образец TS в соответствии с постановкой эксперимента следующим образом:

1) Возьмите 100 мкл тестового образца и добавьте его в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пометьте ее как TS, выполните предварительную обработку образца и подготовьте tо очищатьу тестовый образец.

2) Для соответствия требованию анализа четырех различных длин удлинения одновременно, объем предварительно обработанного тестового образца должен быть ≥120 мкл. Поэтому рекомендуется подготовить 2 пробирки каждого образца для предварительной обработки, а после экстракции смешать их вместе для использования.

3. Приготовление отрицательного контроля экстракции (NCS)

Подготовьте отрицательный контроль экстракции NCS в соответствии с экспериментальной схемой следующим образом:

1) Возьмите 100 мкл раствора матрицы образца (или разбавленной ДНК) буфер) и добавьте его в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Обозначьте его как NCS.

2) Проведите предварительную обработку образца отрицательного контроля NCS вместе с партией тестовых образцов и приготовьте очищенный раствор отрицательного контроля NCS.

3) Для соответствия требованиям анализа четырех различных длин удлинения одновременно объем предварительно обработанного образца NCS должен быть ≥120 мкл. Поэтому рекомендуется подготовить 2 пробирки каждого образца NCS для предварительной обработки, а после экстракции смешать их для использования.

4. Подготовка контроля без шаблона (NTC)

Подготовьте контрольный образец NTC без шаблона в соответствии с экспериментальной установкой следующим образом:

1) Контроль без шаблона (NTC) не требует образца предварительная обработка, и может быть подготовлен, начиная с этапа обнаружения остаточного содержания ДНК с помощью ПЦР в реальном времени.

2) Для каждой пробирки или лунки образец NTC состоит из 20 мкл смеси (т. е. 15 мкл смеси HEK293 qPCR + 5 мкл соответствующей смеси праймеров и зондов HEK293) + 10 мкл буфера для разбавления ДНК. Рекомендуется приготовить достаточно для 3 повторных лунок.

5. система реакции ПЦР

Стол 2. Реакционная система для Фрагмент 82 п.н.

Стол 3. Реакционная система для 133 фрагмент bp

Стол 4. Реакционная система для 227 фрагмент bp

Стол 5. Реакционная система для 515 фрагмент bp

* Чтобы рассчитать общее количество смеси, необходимое для этой реакции, исходя из количества лунок:

Смесь = (Количество реакционных лунок + 2) × (15 + 5) мкл (для учета потери 2 лунок). Обычно для каждого образца готовят 3 повторных лунки.

** Количество реакционных лунок = (5 лунок стандартной кривой градиента концентрации + 1 контроль без матрицы (NTC) + 1 раствор отрицательного контроля (NCS) + N тестовых образцов (TS)) × 3.

NTC (без контроля шаблона): буфер для разбавления ДНК

NCS (отрицательный контрольный раствор): раствор матрицы образца или буфер для разбавления ДНК после предварительного анализа образца.-уход для получения очищенного раствора, которым является НКС.

TS (тестовый образец): образец, подлежащий тестированию.

***После распределения образцов и запечатывания пробирок, кратковременно центрифугируйте на низкой скорости (10 сек), чтобы собрать жидкость со стенок пробирки на дно. Затем встряхивайте в течение как минимум 5 секунд, чтобы тщательно перемешать. После этого выполните еще одно центрифугирование на низкой скорости (10 сек). Если есть пузырьки, обязательно удалите их.

Таблица 6: Схема расположения контрольной пластины

Этот пример показыватьпроцедура обнаружения методом ПЦР для анализа фрагментов амплификации остаточной ДНК HEK293.Тестовые образцы включают: 5 градиентов концентрации стандартной кривой ДНК HEK293, 1 тестовый образец (TS), 1 отрицательный контрольный раствор (NCS) и 1 контроль без матрицы (NTC). Рекомендуется запустить 3 повторных лунки для каждого образца.

6. Параметры программы амплификации (Tтри-шаговый метод) (Пример использования прибора ABI 7500 qPCR, версия программного обеспечения 2.0)**

1) Создайте новую пустую программу и выберите «Абсолютный количественный анализ» в качестве шаблона обнаружения.

2) Для четырех различных длин фрагментов амплификации создайте новые зонды обнаружения, назвав их "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227" и "HEK293-515". Выберите репортерный флуорофор как "FAM", а гасящий флуорофор как "none". Установите референтный краситель для обнаружения как "ROX" (референтный краситель может быть добавлен или нет в зависимости от модели прибора и других факторов).

3) На панели «Назначить целевые объекты выбранным лункам» установите поле «Задача» для лунок стандартной кривой как «Стандарт» и назначьте соответствующие значения в поле «Количество» как «300000», «30000», «3000», «300», «30» (представляющее концентрацию ДНК на лунку в фг/мкл). Назовите лунки в поле «Название образца» как «300 пг/мкл», «30 пг/мкл», «3 пг/мкл», «300 фг/мкл», «30 фг/мкл». Для лунок NTC установите «Задача» на «NTC». Для лунок NCS и TS установите «Задача» на «Неизвестно» и назовите лунки «NCS» и «TS» в поле «Название образца». После установки этих параметров нажмите кнопку «Начать запуск», чтобы начать запуск прибора.

4) Настройки программы амплификации: Установите трехэтапную программу амплификации с объемом реакции 30 мкл.

Стол7. ПЦР-процедура

7. Анализ результатов ПЦР

1) На панели «Анализ» в разделе «График амплификации» система автоматически установит «Порог». Иногда «Порог» по умолчанию слишком близок к базовой линии, что приводит к значительному изменению Ct между репликатами. Вы можете вручную настроить «Порог» в подходящем положении и нажать «Анализ». На этом этапе вы можете предварительно проверить кривые амплификации в «Многокомпонентном графике», чтобы убедиться, что они нормальные.

2) На панели «Анализ» в разделе «Стандартная кривая» вы можете прочитать R² стандартной кривой, эффективность амплификации (Eff%), наклон и точку пересечения. Для нормальной стандартной кривой: R² > 0,99, эффективность амплификации (90% ≤ Eff% ≤ 110%) и наклон между -3,6 и -3,1.

3) На панели «Анализ» в разделе «Просмотр таблицы лунок» вы можете прочитать столбец «Количество» для контроля без шаблона (NTC), отрицательного контроля (NCS) и тестовых образцов (TS) с единицей измерения в фг/мкл. Единицы можно будет преобразовать позже в отчете.

4) Параметры настройки для анализа результатов должны зависеть от конкретной модели прибора и версии программного обеспечения. Обычно прибор может автоматически интерпретировать результаты.

5) Значение Ct отрицательного контроля (NCS) должно быть больше среднего значения Ct самой низкой концентрации стандартной кривой.

6) Результат контроля без шаблона (NTC) должен быть «Не определен» или иметь значение Ct ≥ 32.

Документ

Руководство