1 Verkningsprincipen för genetikomycin

Genetomycin (Geneticin, G418) är ett aminoglykosidantibiotikum som hämmar proteinsyntesen genom att blockera peptidkedjeförlängningen genom att binda till 70S och 80S ribosomerna i prokaryota och eukaryota celler. Denna mekanism är giftig för de inklusive bakterier, jäst, växter och däggdjursceller. När cellerna framgångsrikt transfekterades och integrerades med en neomycinresistensgen (såsom neo-genen), kunde det genkodade aminoglykosidfosfotransferaset (APH (3) II) kovalent modifiera G418 för att inaktivera det, och därigenom ge resistens mot celler odlade i selektivt medium innehållande G418.

I molekylärgenetiska tester är G418 en av de som ofta används för stabil transfektion.

2 Appliceringen av geneomycin

2.1 Screening av stabila transfekterade cellinjer

• G418 användes för att screena efter celler som innehöll resistensgener (t.ex. neo-gener) genom att hämma proteinsyntes. Aminoglykosidfosfotransferaset som kodas av resistensgenen inaktiverar G418, vilket ger cellresistens till G418. Typiskt är screeningintervallet för däggdjursceller 200 – 2000 μg/mL, med den vanligaste arbetskoncentrationen på 100 – 700 μg/ml. Där växtceller är 10-100 μg/mL och jästceller är 500-1000 μg/ml, är följande koncentrationer som används för vissa celltyper med G418 som referens.

Cell	Ansökan	Aktiveringskoncentration av geneomycin (μg/mL)	Anförda verk
Mucor arter	a) Odlad i tillväxtmedium b) Odlade på lyofiliserade bakterier	a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml	Hirth, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
Däggdjurs	a) För screening b) För att upprätthålla tillväxten	a) 400 -1000 μg/ml b) 200 μg/ml	Canaani och Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
Plantera	a) För screening b) För att upprätthålla tillväxten	a) 25-50 μg/ml b) 10 μg/ml	Ursic, et. al., Biochem. Biophys. Res. Komm., v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Jäst	a) För screening b) För att upprätthålla tillväxten	a) 500 μg/ml b) 125-200 μg/mL	Jimenez och Davies, Natur, v. 287, 869-871 (1980).
Bakterier	För screening	16 μg/ml	Waitz, et. al., Antimikrob. Agenter Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Genknockout och genöverföring

• I gen knockout kan G418 användas för att screena celler som framgångsrikt knockout målgenen. Vid genöverföring underlättar G418 integreringen av främmande gener i genomet av värdceller.

2.3 Resistensval i cellkultur

• Under cellodling används G418 för att screena efter celler som är resistenta mot antibiotikan, som ofta bär specifika resistensgener.

3 Relevanta experimentella förfaranden för geneomycin

3.1 Beredning av G418 stamlösning (50 mg/ml, aktiv koncentration)

1) Konvertering av aktivitetsenheter

Konvertera med formeln: (1000/A0) × A1 = A2, där A0 är styrkan för G418, som varierar med batch. Se kvalitetskontrollrapporten för motsvarande batch eller etiketten på flaskan. Al är den önskade aktiva koncentrationen av G418 som ska framställas. A2 är den faktiska koncentrationen av pulver till volym som ska vägas.

Till exempel, om satsen av G418 har en styrka på 750 U/mg och du vill förbereda en aktiv koncentration på 50 mg/mL, då är den faktiska pulverkoncentrationen som ska förberedas 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/ml.

Om man bereder 10 ml G418 stamlösning (aktiv koncentration, 50 mg/ml), krävs 666,7 mg pulver.

• Sterilisering och förvaring

Baserat på den faktiska pulvervikten som erhållits från ovanstående omvandling, tillsätt det till 10 ml sterilt avjoniserat vatten för att helt lösas upp.

Förvätt först ett 0,22 μm sprutfilter med 5 mL sterilt avjoniserat vatten, ta bort allt vatten. Filtrera sedan med hjälp av detta filter för att sterilisera och alikvotera i små volymer för engångsbruk (t.ex. 1 mL) och förvara vid -20°C under 1 års stabilitet.

3.2 Etablering av Kill Curve

1) Dag ett: Platta otransformerade celler vid 20-25 % celldensitet i lämpliga odlingsplattor och inkubera över natten vid 37°C, CO₂.

2) Ställ in en koncentrationsgradient inom ett lämpligt intervall baserat på celltyp, välj minst 6 koncentrationer (G418 är mest aktiv mot celler i delningsfasen, så cellerna bör odlas under en period innan G418 tillsätts), till exempel för däggdjursceller, ställ in 0, 50, 100, 200, 400, 1000 μg/mL.

3) Dag två: Ta bort gammalt odlingsmedium och ersätt med nyberedd medium innehållande motsvarande koncentration av läkemedlet, med tre replikat för varje koncentration.

4) Byt ut med färskt läkemedelsinnehållande medium var 3-4 dag.

5) Utför levande cellräkningar med fasta intervall (t.ex. varannan dag) för att bestämma lämplig koncentration som förhindrar tillväxten av otransfekterade celler. Välj den lägsta koncentrationen som kan döda majoriteten av celler inom det ideala antalet dagar (vanligtvis 7-10 dagar) som arbetskoncentration för stabil transfekterad cellinjescreening.

3.3 Screening av stabila transfekterade celler

• G418 Geneticin (60220ES) som tillhandahålls av Yisheng Biotech har en effekt på ≥720 U/mg, en renhet på ~98%, och batchstabilitet, med ett pris på nästan en tredjedel av andra företags G418-produkter.
• Screeningsmediet innehållande läkemedlen ersattes var 3-4 dag.
• Bildandet av cellkloner (kolonier) observerades och bedömdes efter 7 dagars selektion. Kolonier kan ta en vecka eller mer att bilda, beroende på värdcellstyp, transfektion och screeningseffektivitet.
• 5-10 resistenta kloner plockades och överfördes till 35 mm cellodlingsplattor och hölls vidare med läkemedelsinnehållande screeningmedium i 7 dagar.
• Efter att ha ändrat den normala mediumkulturen.

4 Produktrekommendation

G418 Geneticin (60220ES) tillhandahållen av Yeasen Biotech har en effekt på ≥720 U/mg, en renhet på ~98% och batchstabilitet, med ett pris på nästan en tredjedel av andra företags G418-produkter.

Specifikation	S*	T*	Yeasen	Yeasen fördel
Innehåll (HPLC)	/	/	~98 %	Hög renhet
Styrka (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 ug/mg	≥720 µg/mg	Hög effektivitet
Pris ($/5 g)	~1000	~1000	~200	Billighet

5 Experimentellt fall

I E. coli var G69 och G99 två olika batcher; koncentrationerna av genomycin var 8 mg/L, 12 mg/L respektive 16 mg/L, och den effektiva minimikoncentrationen var 16 mg/L, vilket helt hämmade tillväxten av diverse bakterier.