Vad är Aureobasidin A
Aureobasidin A (AbA) är ett cykliskt peptidantibiotikum isolerat från trådsvampen Aureobasidium pullulans nr R106, som har starka svampdödande egenskaper och kan vara giftigt för jäst i låga koncentrationer (0,1-0,5 μg/mL). Verkningsmekanismen för AbA är genom hämning av aktiviteten av inositol-fosforylceramidsyntas (IPC-syntas), ett enzym som kodas av AUR1-genen i jäst, vilket blockerar syntesen från ceramid till inositolfosfolipider, vilket leder till brist på sfingolipider, vilket leder till brist på sfingolipider, vilket dödar cellmembranet. Svamparter som är känsliga för AbA inkluderar Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans och A. niger.
Figur 1 Strukturformel för AbA, CAS#127785-64-2
Forskning har funnit att AUR1-genen från Saccharomyces cerevisiae och AURA-genen från Aspergillus nidulans är homologa, båda kodar för IPC-syntas. Därför kan mutationer i dessa två gener ge stark AbA-resistens mot stammar, såsom den muterade genen AUR1-C. AbA är mycket lämplig som läkemedelsselektionsmarkör för screening av positiva kloner, och det kräver inte tillståndsoptimering, med mycket låg bakgrund. AbA-resistens är också en idealisk reporter för studier av enkel/dubbelhybrid jäst och är kompatibel med jästhybridsystem som bär motsvarande resistens.
Vad är jäst Single/Double Hybrid System
Jäst tvåhybridsystemet (Jäst tvåhybridanalys) skapades av Fields och Song och andra baserat på egenskaperna hos eukaryotisk transkriptionsreglering. Den kan snabbt och direkt analysera interaktionerna mellan kända proteiner och används i stor utsträckning i studiet av antigen-antikroppsinteraktioner, upptäckten av nya proteiner och nya proteinfunktioner, screening för läkemedelsmål och upprättande av genomiska proteinlänkskartor. Principen för jäst två-hybrid är att transkriptionsaktivatorn av eukaryoter innehåller två olika strukturella domäner: DNA-bindningsdomänen (DNA-bindande domän, DNA-BD) och DNA-transkriptionsaktiveringsdomänen (Activation Domain, AD), som kan separeras oberoende utan att påverka varandras funktion. BD och AD ensamma kan inte aktivera det transkriptionella svaret, endast när de två är tillräckligt nära varandra uppvisar de aktiviteten av en komplett transkriptionell aktivator, vilket tillåter nedströmsgenen att transkriberas. Genom att konstruera fusionsplasmider av de två proteinerna som studeras (protein X och protein Y) med BD- respektive AD-domäner och uttrycka dem i samma jästcell, om det inte finns någon interaktion mellan de två proteinerna, kommer reportergenen inte att transkriberas; om de två proteinerna interagerar kommer BD- och AD-domänerna att vara rumsligt nära, sålunda transkriberas reportergenen.
Figur 2 Principdiagram av jäst två-hybrid [1]
Jäst en-hybrid-teknologi är ett verktyg för att studera nukleinsyra-protein-interaktioner, utvecklat på basis av jäst två-hybrid, och används flitigt för att studera uttrycksregleringen av gener i eukaryota celler, såsom att identifiera om det finns en interaktion mellan känt DNA och kända proteiner; isolering av nya proteiner som binder till mål-cis-regulatoriska elementet eller andra korta DNA-bindningsställen; exakt lokalisering av DNA-bindningsställena som har visat sig interagera och analysera DNA-bindningsdomänerna hos proteiner. Dess grundläggande princip är att konstruera det kända cis-verkande elementet uppströms om den mest grundläggande promotorn (minimal promotor, Pmin) och koppla reportergenen nedströms om Pmin. Det cDNA som kodar för transkriptionsfaktorn som ska testas fusioneras med jäst-AD-domänexpressionsvektorn och introduceras i jästceller.Om produkten av denna gen kan binda till det cis-verkande elementet, kan den aktivera Pmin-promotom, vilket gör att reportergenen kan uttryckas.
Figur 3 Principdiagram för jäst en-hybrid [2]
För studier av enkel-/dubbelhybrid jäst erbjuder Yeasen produkt 60231ES Aureobasidin A (AbA), en lösning av AbA löst i metanol med en renhet på ≥ 97 % och en koncentration av 1 mg/ml. Yeasen rekommenderar en AbA-hämmande koncentration på 100-1000 ng/ml i enkel-/dubbelhybridexperiment med jäst, och den specifika arbetskoncentrationen beror på värdcellernas känslighet (se följande tabell, Minsta hämmande koncentrationer (MIC) av AbA för olika jäststammar).
| Bakteriell stam | MIC (ng/ml) | |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diploid) | 200-400 |
| SH3328 (haploid) | 100 | |
| Sake jäst (diploid) | 100-200 | |
| Shochu jäst (diploid) | 100 | |
| Öljäst (triploid eller tetraploid) | 100 | |
| Bagerijäst (diploid) | 200-400 | |
| Schizo.pombe | JY-745 (monoploid) | 100 |
| C.albicans | TIMM-0136 (diploid) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (diploid) | 80 |
Ansökningsfall
För att studera bindningsstället för GmWRKY31-proteinet på promotorn av GmSAGT1-genen, i jäst-enhybridexperimentet, infogades mål-DNA-sekvensen i pBait-AbAi-vektorn innehållande uracilreportergenen Ura3, belägen uppströms om AUR1-C-genen. Efter jästtransformation med motsvarande plasmid suspenderades den i 0,9% NaCl-lösning och OD600 justerades till 0,005. Därefter spreds 100 μL av provet på plattor innehållande 500 ng/mL AbA, vänds upp och ner och odlades vid 30 ℃ i 3-5 dagar[3].
Figur 3 Interaktion av GmWRKY31-protein med jäststammar som innehåller fragmenten F16, F20, F73, delF16, delF20 eller delF73.
Publicerade artiklar med våra reagenser
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li,, et al. Kväve förmedlar blomningstid och kväveanvändningseffektivitet via blomregulatorer i ris, Current Biology, Volum 31, Issue 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (OM:10,834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Ett NnSnRK1-centrerat regulatoriskt nätverk av skugga-inducerad tidig avslutning av blomning i lotus, miljömässig och experimentell botanik, volym 221,2024,105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (OM:5.7)
Relaterade produkter
| Produktnamn | Katt# | Specifikation |
| Ciprofloxacinhydroklorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, natriumsalt | 60203ES10/60 | 10/100g |
| Doxycyklinhyklat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Kloramfenikol, USP-klass | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycinsulfat | 60206ES10/60 | 10/100g |
| Tetracyklin HCl Tetracyklinhydroklorid (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vankomycinhydroklorid | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycinsulfatsalt | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Spectinomycinhydroklorid | 60215ES08 | 5g |
| Fleomycin (20 mg/ml i lösning) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfate (geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 g |
| Puromycin (lösning 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1 x 1 / 5 x 1 / 1 0 x 1 / 50 x 1 ml |
| Puromycin dihydroklorid | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 g |
| Hygromycin B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 mL)/10 × 1 g (20 mL) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10 g |
| Erytromycin | 60228ES08/25 | 5/25 g |
| Timentin | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polymyxin B-sulfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |
Referensdokumentation
[1] Paiano A, et al. Jäst två-hybridanalys för att identifiera interagerande proteiner. Curr Protoc Protein Sci. 2019 feb;95(1):e70.
[2] John S, et al. Jäst en-hybridanalyser: ett historiskt och tekniskt perspektiv. Metoder. 2012 augusti;57(4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Transkriptomanalys av sojabönor WRKY TFs som svar på Peronospora manshurica-infektion. Genomik. 2019 Dec;111(6):1412-1422.