1 Aaktionsprincipen
Hygromycin B är ett aminoglykosidantibiotikum som produceras av metabolismen av Streptomyces hygroscopicus, vilket hämmar proteinsyntesen genom att störa translokation och främja felläsning av 80S-ribosomer, och därigenom döda prokaryota och eukaryota celler.
För närvarande används det vanligtvis för att screena och underhålla prokaryota eller eukaryota celler som innehåller hygromycinresistensgenen.
2 Tillämpning
2.1 Avskärma och underhålla odling av prokaryota eller eukaryota celler (växtceller och däggdjursceller) stabilt transfekterade med Hph+vektorerHygromycin B resistensgen (hyg eller hph) härledd från Escherichia coli. kodar för hygromycin B-fosfotransferas, som omvandlar hygromycin B till en biologiskt inaktiv fosforylerad produkt, och därigenom avgiftar. Med tanke på denna princip är hygromycin B en mycket användbar selekterbar markör för att screena och underhålla odlade prokaryota eller eukaryota celler som framgångsrikt transfekterats med hygromycinresistensgenen.
2.2På grund av skillnaden i verkningssätt används hygromycin B ofta i kombination med geneticin G418, bleomycin och blasticidin för att screena cellinjer stabilt transfekterade med två olika vektorer.Hygromycin B har ett annat verkningssätt än G418 (Cat#60220ES), Bleomycin(Cat#60257ES) och Blasticidins(Cat#60218ES), så det är väl lämpat för användning i kombination med andra selektiva antibiotika i dubbelselektionsexperiment.
2.3 Antiviralt medel2.4 Som ett anthelmintikum läggs det till djurfoder och djur föds upp.
2.5 Screening av stabilt transfekterade celler
Arbetskoncentrationen av hygromycin B som används för att screena stabila transfektanter varierar beroende på celltyp, medium, tillväxtförhållanden och cellmetabolism. Den rekommenderade koncentrationen är 50-1000 μg/mL. För den första användningen av det experimentella systemet rekommenderas att den optimala screeningskoncentrationen bestäms genom att upprätta en dödskurva, dvs en dos-responskurva. I allmänhet 50-500 μg/mL för däggdjursceller; 20-200 μg/mL för bakterier/växtceller; 200-1000 μg/mL för svampar.
3 Protokoll
3.1 Beredning av förvaringslösning (50 mg/ml)
Väg 0,5 g hygromycin B och tillsätt 10 ml 1×PBS, pH 7,4. Efter helt upplöst, filtrera med ett 0,22 μm filter för sterilisering. Alikvotera den steriliserade lösningen och förvara vid -20 ℃.
3.2 Vanligt använda screeningkoncentration
Arbetskoncentrationen av hygromycin B för screening av stabila stammar varierar beroende på celltyp, odlingsmedium, tillväxtförhållanden och cellmetabolism. Det rekommenderas att upprätta en dödskurva (dos-responskurva) för att bestämma den optimala screeningskoncentrationen för första gången. Generellt gäller däggdjursceller: 50-500 μg/ml; Bakterie-/växtceller: 20-200 μg/mL; Svampar: 300-1000 μg/mL.
3.3 Etablering av dödande kurva
【Notera】 För att screena stabila cellinjer är det nödvändigt att bestämma den lägsta koncentrationen av antibiotika som kan döda otransfekterade värdceller. Detta kan uppnås genom att upprätta en dödande kurva (dos-respons-kurva). Minst fem koncentrationer bör ordnas.
1) Dag 1: Otransformerade celler plankas i en lämplig odlingsplatta med en celldensitet av 20-25% och odlas över natten.【Notera】 Mängden inokuleringsceller kan ökas för celler som kräver högre densitet för att upptäcka vitalitet.
2) Ställ in koncentrationsgradienten inom lämpligt område enligt celltypen. Däggdjursceller kan ställa in 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Späd hygromycin B-lösningen 1:10 med avjoniserat vatten eller PBS-buffert till 5 mg/ml. Späd sedan lösningen till motsvarande arbetskoncentration enligt följande tabell.
| Slutlig koncentration (μg/ml) | Medium volym (ml) | Tillsatsvolym på 5 mg/ml Hygromycin B (mL) |
| 50 | 9.9 | 0,1 |
| 100 | 9.8 | 0,2 |
| 250 | 9.5 | 0,5 |
| 500 | 9,0 | 1.0 |
| 750 | 8.5 | 1.5 |
| 1000 | 8,0 | 2.0 |
3) Dag 2: Ersätt med ett nyberedd medium som innehåller motsvarande koncentration av läkemedlet. Gör tre parallella prover för varje koncentration.
4) Byt ut mot färskt medium som innehåller läkemedel var 3-4 dag.
5) Antal levande celler utförs vid en fast cykel (t.ex. varannan dag) för att bestämma lämplig koncentration för att förhindra tillväxt av otransfekterade celler. Välj den lägsta koncentrationen som dödar majoriteten av cellerna inom ett idealiskt antal dagar (vanligtvis 7-10 dagar), som arbetskoncentration för screening av stabil cellinje.
3.4 Screening av stabila transfekterade celler
1) 48 timmar efter transfektion subodlades cellerna genom screeningmedium innehållande hygromycin B i lämplig koncentration (direkt eller utspädd). 【Obs!】Antibiotika fungerar bäst på aktivt delande celler. Om cellerna är för täta kommer inte antibiotikan att döda cellerna. Dela cellerna så att cellerna inte är mer än 25% konfluenta.
2) Byt screeningmedium var 3-4 dag.
3) Mät cellkolonibildningen efter 7 dagars screening. Kolonibildning kan ta ytterligare en vecka eller mer, beroende på värdcellstyp, transfektion och screeningseffektivitet.
4) Välj 5-10 resistenta kloner och överför till 35 mm cellodlingsplattor och odlas i läkemedelsinnehållande screeningmedium i 7 dagar.
5) Ersätt med färskt medium utan läkemedel för odling.
4 Egenskaper
Hygromycin B är ett vitt till gulbrunt pulver med en speciell lukt, lättlösligt i vatten, metanol, etanol etc. och bildar lätt salter med många organiska och oorganiska syror.
5 Produktförvaring
Lösningen kan lagras direkt vid 2~8 ℃ och kan lagras i mer än 6 månader.
6 Varning
1) Cellerna transfekterade med hph-genen är resistenta mot hygromycin, och de transfekterade cellerna uttrycker genen stabilt eller temporärt.
2) Hygromycin B-resistensgenen (hyg eller hph) hittades i andra stammar, inklusive Streptomyces hygroscopicus och Klebsiella pneumoniae, förutom E. Coli.
7 Produktrekommendation
Yeasen tillhandahåller Hygromycin B i två former, pulver (1 g/10 g, Kat#60225ES) och lösning (50 mg/ml, Kat#60224ES).
| Produktnamn | Katt# | Specifikation |
| Hygromycin B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 ml) |
| 60224ES10 | 10×1 g (20 ml) | |
| Hygromycin B | 60225ES03 | 1 g |
| 60225ES10 | 10 g |
8 Publicerade artiklar med våra reagenser
[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS underlättar kompartmentaliserad LTBP1 S-nitrosylering och främjar tumörtillväxt under hypoxi. Mol Cell . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (IF:14.548)
[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX, et al. Dynamisk kromatintillståndsprofilering avslöjar reglerande roller för auxin och cytokinein i skottregenerering. Dev Cell . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (IF:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW. En encellsanalys av Arabidopsis vegetativa skottspets. Dev Cell . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (IF:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. Kromatintillgänglighetsdynamik och en hierarkisk transkriptionell regulatorisk nätverksstruktur för växtsomatisk embryogenes. Dev Cell . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (IF:10.092)
[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY, et al. Genomomfattande CRISPR/Cas9-screening identifierar CARHSP1 ansvarig för strålningsmotstånd i glioblastom. Celldöd Dis . 2021;12(8):724. Publicerad 2021 21 juli. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (IF:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Transcriptional Activation Screening i metforminresistensrelaterad gen av prostatacancer. Front Cell Dev Biol . 2021;8:616332. Publicerad 2021 26 januari. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (IF:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z, et al. Engineering av Yarrowia lipolytica transportörer för högeffektiv produktion av biobaserad bärnstenssyra från glukos. Bioteknik Biobränslen . 2021;14(1):145. Publicerad 2021 27 juni. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (IF:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. Konstruerar den oljiga jästen Yarrowia lipolytica för produktion av α-farnesen. Bioteknik Biobränslen . 2019;12:296. Publicerad 2019 23 dec. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (IF:5.452)
[9] Zhou C, Zeng Z, Suo J, et al. Manipulering av en enda transkriptionsfaktor, Ant1, främjar antocyaninackumulering i kornkorn. J Agric Food Chem . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (IF:5,279)
[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, et al.Identifiering och karakterisering av mitokondriella replikationsursprung för stabilt och episomalt uttryck i Yarrowia lipolytica. ACS Synth Biol . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (IF:5.110)
9 Relaterade produkter
| Produktnamn | Katt# | Specifikation |
| Ciprofloxacinhydroklorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, natriumsalt | 60203ES10/60 | 10/100g |
| Doxycyklinhyklat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Kloramfenikol, USP-klass | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycinsulfat | 60206ES10/60 | 10/100g |
| Tetracyklin HCl Tetracyklinhydroklorid (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vankomycinhydroklorid | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycinsulfatsalt | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Spectinomycinhydroklorid | 60215ES08 | 5g |
| Fleomycin (20 mg/ml i lösning) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfate (geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 g |
| Puromycin (lösning 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1 x 1 / 5 x 1 / 1 0 x 1 / 50 x 1 ml |
| Puromycin dihydroklorid | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 g |
| Hygromycin B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 mL)/10 × 1 g (20 mL) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10 g |
| Erytromycin | 60228ES08/25 | 5/25 g |
| Timentin | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polymyxin B-sulfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |