Apoptos hänvisar generellt till ett slags programmerad celldöd som sker genom reglering av intracellulära gener och deras produkter under utvecklingen av celler eller under inverkan av vissa faktorer. Apoptos spelar en viktig roll i embryonal utveckling och morfogenes, stabiliteten hos normala cellpopulationer i vävnader, kroppens försvar och immunsvar, cellskador och åldrande orsakade av sjukdom eller förgiftning, och förekomst och progression av tumörer, och har potentiell terapeutisk betydelse.

Händelserna i den apoptotiska vägen inträffar i en tidssekvens, det vill säga händelserna inträffar i sekvens, och leder så småningom till uppkomsten av apoptotiska kroppar, med förekomsten av apoptos.

Dess typiska egenskaper är följande:

1. Tidig apoptos: cellmembranstruktur förändringar, fosfatidylserin eversion;

2. Tidigt och mellanstadium apoptos: tätheten av cytoplasman ökade, den mitokondriella membranpotentialen försvann, permeabiliteten förändrades och cytokrom C släpptes in i cytoplasman;

3. Sen apoptos: apoptossignaltransduktion;

4. Sen apoptos: DNA bryts ned till 180~200bp fragmentstorlek.

Figur 1: Förekomst och detektion av sekventiella händelser i apoptosvägen

1. Tidig apoptos: Annexin-V/PI dubbelfärgning (detektion av PS på det extracellulära membranet)

I normala levande celler finns fosfatidylserin (PS) på insidan av cellmembranet. När apoptos inträffar förändras cellmembranet och PS vänder från cellmembranets inre yta till cellmembranets yttre yta. Annexin-V är ett Ca2+-beroende fosfolipidbindande protein med en molekylvikt på 35-36 KD, som kan binda till PS med hög affinitet. Genom att använda Annexin-V märkt med fluorescein (FITC, Alexa fluor488, etc.) som en sond, kan apoptotiska celler och levande celler identifieras med flödescytometri eller fluorescensmikroskop.

PS av nekrotiska celler kommer också att vända över från den inre ytan av cellmembranet till den yttre ytan av cellmembranet. Annexin-V kan också känna igen PS på ytan av nekrotiska celler, så Annexin-V kan inte skilja nekrotiska celler från apoptotiska celler. Dessutom är propidinjodid (PI) ett nukleinsyrafärgämne, som kan binda till DNA i celler, och det kan inte penetrera hela cellmembranet. Cellmembranet hos tidiga apoptotiska celler och levande celler är fortfarande intakt, och PI-färgämne kan inte komma in i cellen fritt genom cellmembranet för att binda med DNA, så PI-färgämne kan inte märka apoptotiska celler och levande celler, men PI-färgämne kan binda med DNA i cellen genom cellmembranet hos nekrotiska celler. PI-färgämne i de döda cellerna kommer att avge röd fluorescens efter att ha exciterats av 488nm laser, och kommer att tas emot av motsvarande kanal. Därför kan Annexin V och PI användas tillsammans för att skilja levande celler, tidiga apoptotiska celler och nekrotiska celler.

Figur 2: Analys av flödescytometriresultat efter annexin-v/pi dubbelfärgning

Beställa produkter:

2. Tidig apoptos: JC-1-färgning (detektion av mitokondriella membranpotentialförändringar)

Processen med apoptos åtföljs ofta av förstörelsen av mitokondriell transmembranpotential, vilket allmänt anses vara en av de tidigaste händelserna i processen med apoptoskaskaden. Det inträffar före uppkomsten av egenskaperna hos nukleär apoptos (kromatinkoncentration, DNA-brott). När den mitokondriella transmembranpotentialen kollapsar är cellapoptos irreversibel. Förekomsten av mitokondriell transmembranpotential gör det möjligt för vissa lipofila katjoniska fluorescerande färgämnen såsom rhodamine 123, JC-1, JC-10 att binda till mitokondriella matrisen. Ökningen eller minskningen av deras fluorescens indikerar ökningen eller minskningen av elektronegativiteten hos mitokondriernas inre membran.

JC-1 används ofta för att detektera mitokondriell membranpotential △ΨM, vilket visar potentialberoende ackumulering i mitokondrier. I normala mitokondrier aggregerar JC-1 i den mitokondriella matrisen för att bilda en polymer, som avger stark röd fluorescens (ex=585 nm, em=590 nm); I apoptotiska celler depolariserades mitokondriella transmembranpotential, JC-1 frigjordes från mitokondrier, koncentrationen minskade och vändes till monomerformen som avgav grön fluorescens. Därför återspeglar förändringen av färg direkt förändringen i mitokondriell membranpotential. Graden av mitokondriell depolarisering kan också mätas genom förhållandet mellan röd/grön fluorescensintensitet. JC-1-detektion är en vanlig metod.

3. Sen apoptos: TUNEL-metod (DNA-fragment in situ-märkningsmetod)

I det sena stadiet av apoptos produceras ett stort antal klibbiga 3-OH-terminaler på grund av dubbelsträngsbrott eller enkelsträngsbrott av kromosomalt DNA. Under inverkan av deoxiribonukleotidterminalt transferas (TdT), kan luciferasmärkt dUTP bindas till 3-terminalen av DNA, så att apoptotiska celler kan detekteras, sådana metoder kallas terminal deoxinukleotidyltransferasmedierad dUTP nick end-märkning (TUNEL). Eftersom normala eller prolifererande celler nästan inte har några DNA-avbrott, finns det ingen 3-OH-bildning och få kan färgas. TUNEL är egentligen en forskningsmetod som kombinerar molekylärbiologi och morfologi. In situ-färgning av en komplett enda apoptotisk kärna eller apoptotisk kropp kan exakt återspegla de typiska biokemiska och morfologiska egenskaperna hos apoptos. Det kan användas för att bestämma cellmorfologin för paraffininbäddade vävnadssektioner, frusna vävnadssektioner, odlade celler och celler isolerade från vävnader, och kan detektera ett mycket litet antal apoptotiska celler, därför används det i stor utsträckning i studiet av apoptos.

Relaterade produkter: