Puromycin är ett aminoglykosidantibiotikum som produceras av Streptomyces alboniger. Det är en analog till 3'-änden av aminoacyl-tRNA-molekylen och kan binda till A-stället i ribosomen, införlivas i den förlängda peptidkedjan, störa peptidtranslokationen på ribosomen, orsaka för tidig kedjeterminering under translation och därmed hämma proteinsyntesen.
Figur 1 Strukturformel för Puromycin (CAS-NR 53-79-2)
Pac-genen, som kodar för puromycin N-acetyltransferas (pac), hittades i den puromycinproducerande bakterien Streptomyces alboniger, vilket ger resistens mot puromycin. Denna egenskap används nu i stor utsträckning för att screena stabila transfekterade cellinjer från däggdjur som bär plasmider med pac-genen. Den utbredda användningen av puromycin vid screening av stabila cellinjer är relaterad till egenskaperna hos lentivirala vektorer, av vilka de flesta bär pac-genen i kommersiella lentivirala vektorer. I vissa specifika fall kan puromycin också användas för att screena E. coli-stammar transformerade med plasmider som bär pac-genen. Puromycin verkar snabbt och kan snabbt orsaka celldöd vid låga koncentrationer. Vidhäftande däggdjursceller är känsliga för koncentrationer på 2-5 µg/ml av puromycin, medan suspensionsceller redan är känsliga för koncentrationer så låga som 0,5-2 µg/ml puromycin. Däggdjursceller med stabil resistens mot puromycin kan genereras inom en vecka.
Screening av stabil celllinje
Experimentell princip
Genom att klona exogent DNA/shRNA i en vektor som bär pac-genen transfekteras den rekombinanta vektorn in i värdceller och integreras i deras kromosomer, överförs stabilt med celldelning och screenas slutligen med puromycin.
Förberedelse och förexperiment
1 Rekommenderade användningskoncentrationer
Däggdjursceller: 1-10 μg/mL, den optimala koncentrationen måste bestämmas genom förexperiment.
E.coli: För screening av stabila transformerade E. coli som bär pac-genen på LB-agarmedium, använd en koncentration på 125 μg/ml. Exakt pH-justering krävs för puromycinscreening av E. coli-stabila transformanter.
2 Upplösningsmetod
Lös puromycin i destillerat vatten för att framställa en 50 mg/ml stamlösning, filtersterilisera med ett 0,22 μm filter, alikvot och förvara vid -20°C.
3 Bestämning av Puromycin Kill Curve (med shRNA-transfektion eller lentiviral transduktion som exempel)
Den effektiva screeningskoncentrationen av puromycin är relaterad till celltyp, tillväxtstatus, celldensitet, cellmetabolism och cellcykelposition. Det är avgörande att bestämma den lägsta koncentrationen av puromycin som dödar otransfekterade celler. Det är viktigt att utföra ett Puromycin-gradientscreeningsförexperiment för det första experimentet för att etablera en dödskurva.
- Plattceller med en densitet av 5~8×104celler/brunn i en 24-brunnars platta och odla över natten.
- Förbered screeningmedium: Färskt medium som innehåller olika koncentrationer av puromycin (t.ex. 0-15 μg/ml, minst 5 gradienter).
- Ersätt med nyberedd screeningmedium, fortsätt odlingen och observera celltillväxt, byt ut det färska screeningsmediet varannan till var tredje dag.
- Observera cellöverlevnad dagligen; den läkemedelskoncentration som effektivt dödar alla icke-transfekterade celler inom 4-6 dagar är den lägsta koncentrationen.
Screening av stabila transfektanter
- Efter lentiviral infektion i 48-72 timmar (70-80% konfluens), odlade celler i medium innehållande en lämplig koncentration av Puromycin i minst 48 timmar. När alla celler i den icke-transfekterade kontrollgruppen med puromycin dör, är de återstående cellerna i den virusinfekterade gruppen alla positiva celler.
【Notera】: ① Effekten av antibiotika är mest uttalad när celler är i en aktiv delningsfas. Effekten av antibiotika kommer att minska avsevärt om cellerna är för täta. Celldensiteten bör inte överstiga 25 %. ② Observera celltillväxtstatus dagligen; puromycinscreening kräver minst 48 timmar, och den effektiva koncentrationen av puromycinscreening varar vanligtvis från 3 till 10 dagar. Ju högre MOI för viruset, desto fler kopior av shRNA och puromycinresistensgenen innehåller varje cell. När du utför puromycinscreening, ju högre MOI, desto fler pac-kopior innehåller cellerna, och desto högre koncentration av puromycin kan de tolerera. Justera koncentrationen av puromycin för att screena transfekterade celler, men koncentrationen av puromycin bör inte vara lägre än den minsta effektiva koncentrationen av dödningskurvan;
- Tillsätt odlingsmedium som innehåller den lägsta koncentrationen av Puromycin för att expandera cellerna, och efter att qPCR-testresultaten är kvalificerade, fortsätt med kryokonservering.
| Produkts namn | Katt# | Specifikation | Utseende |
| Puromycin Dihydroklorid CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25 mg | Vitt till ett vitt pulver |
| 60210ES60 | 100 mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 g | ||
| Puromycin (Lösning 10 mg/ml) CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 ml | Lösning (10 mg/ml i H2O) |
| 60209ES50 | 5×1 ml | ||
| 60209ES60 | 10×1 ml | ||
| 60209ES76 | 50×1 ml |
Produktrekommendation
Publikationer av kunder som använder den här produkten (delstatistik: vissa)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y, et al. En icke-kanonisk cGAS-STING-PERK-väg underlättar det translationella programmet som är avgörande för åldrande och organfibros. Nat Cell Biol . 2022;24(5):766- 782. doi:10.1038/s41556-022-00894-z (IF:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J, et al. CD73 i små extracellulära vesiklar härledda från HNSCC definierar tumörassocierad immunsuppression medierad av makrofager i mikromiljön. J Extracellvesiklar . 2022;11(5):e12218. doi:10.1002/jev2.12218 (IF:25.841)
[3] Meng F, Yu Z, Zhang D, et al.Inducerad fasseparation av mutant NF2 fängslar cGAS-STING-maskineriet för att upphäva antitumörimmunitet. Mol Cell . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (IF:17.970)
[4] Chen S, Liu S, Wang J, et al. TBK1-medierad DRP1-inriktning ger nukleinsyraavkänning för att omprogrammera mitokondriell dynamik och fysiologi. Mol Cell . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (IF:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS underlättar kompartmentaliserad LTBP1 S-nitrosylering och främjar tumörtillväxt under hypoxi. Mol Cell . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (IF:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X, et al. Hämning av FACT-komplexet riktar sig mot avvikande Hedgehog-signalering och övervinner motståndet mot utjämnade antagonister. Cancer Res . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (IF:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M, et al. Analys av redoxlandskap och dynamik i levande celler och in vivo med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande sensorer. Nat Protoc . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (IF:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X, et al. Proteomisk analys av lungcancerceller avslöjar en avgörande roll för BCAT1 i cancercellsmetastaser. Teranostik. 2021;11(19):9705-9720. Publicerad 2021 27 september. doi:10.7150/thno.61731 (IF:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y, et al. Uterus globulinassocierat protein 1 (UGRP1) binder podoplanin (PDPN) för att främja en ny inflammationsväg under Streptococcus pneumoniae-infektion. Clin Transl Med. 2022;12(6):e850. doi:10.1002/ctm2.850 (IF:11.492 )
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P, et al. MTOR-signalvägen reglerar makrofagdifferentiering från musmyeloida progenitorer genom att hämma autofagi. Autofagi . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019. 1578040 (IF:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W, et al. SNX10 (sortering av nexin 10) hämmar initiering och progression av kolorektal cancer genom att kontrollera autofagisk nedbrytning av SRC. Autofagi . 2020;16(4):735-749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (IF:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X, et al. MK2 främjar nedbrytning av Tfcp2l1 via β-TrCP ubiquitinligas för att reglera självförnyelse av mus embryonala stamceller. Cell Rep . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (IF:9,423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y, et al. AMPK-medierad fosforylering på 53BP1 främjar c-NHEJ. Cell Rep . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (IF:9,423)
[14] Sun Q, Ye Y, Gui A, et al. MORTALIN-Ca 2+ axel driver medfödd rituximab-resistens vid diffust storcellslymfom. Cancer Lett . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (IF:8.679)
[15] Jin R, Zhao A, Han S, et al. Interaktionen mellan S100A16 och GRP78 aktiva endoplasmatiska retikulum-stress-medierade via IRE1α/XBP1-vägen i renal tubulointerstitiell fibros. Celldöd Dis . 2021;12(10):942. Publicerad 2021 13 oktober. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (IF:8.469)
[16] Zhang P, Zhang Z, Fu Y, et al.K63-kopplad ubiquitination av DYRK1A lindrar genom TRAF2 Sprouty 2-medierad nedbrytning av EGFR. Celldöd Dis . 2021;12(6):608. Publicerad 2021 11 juni. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (IF:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J. Knockdown av OLR1 försvagar den glykolytiska metabolismen för att undertrycka tjocktarmscancercellproliferation och kemoresistens genom att nedreglera SULT2B1 via c-MYC. Celldöd Dis. 2021;13(1):4. Publicerad 2021 17 december. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (IF:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M, et al. Proteinet fosfatas PPM1A defosforylerar och aktiverar YAP för att styra däggdjurs tarm- och leverregenerering. PLoS Biol . 2021; 19(2):e3001122. Publicerad 2021 25 februari doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (IF:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C hämmar replikering av herpes simplex virus 1 genom att reglera distributionen av NRF2 inom celler. Fytomedicin. 2024 feb;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (OM:7.9)
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. Avkodning av metastaseringspotential och optimal postoperativ adjuvant terapi av melanom baserat på metastaspoäng. Celldöd Discov. 2023 25 okt;9(1):397. doi: 10.1038/s41420-023-01678-6. (OM:7.0)
Relaterade produkter
| Produktnamn | Katt# | Specifikation |
| Ciprofloxacinhydroklorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, natriumsalt | 60203ES10/60 | 10/100g |
| Doxycyklinhyklat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Kloramfenikol, USP-klass | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycinsulfat | 60206ES10/60 | 10/100g |
| Tetracyklin HCl Tetracyklinhydroklorid (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vankomycinhydroklorid | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycinsulfatsalt | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Spectinomycinhydroklorid | 60215ES08 | 5g |
| Fleomycin (20 mg/ml i lösning) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfate (geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 g |
| Puromycin (lösning 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1 x 1 / 5 x 1 / 1 0 x 1 / 50 x 1 ml |
| Puromycin dihydroklorid | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 g |
| Hygromycin B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 mL)/10 × 1 g (20 mL) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10 g |
| Erytromycin | 60228ES08/25 | 5/25 g |
| Timentin | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polymyxin B-sulfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |