Emellertid står T4 DNA Ligase fortfarande inför vissa utmaningar i praktiska tillämpningar, inklusive dålig stabilitet, hög adapter-adapter ligering eller lågt utbyte av DNA-bibliotek. Dessa problem kan leda till minskad experimentell effektivitet, minskad datakvalitet, dålig repeterbarhet av experimentella resultat och låg produktrenhet, vilket påverkar den totala effektiviteten av molekylärbiologiska experiment och noggrannheten i sekvenseringsdata. För att ta itu med dessa problem har Yeasen, baserat på dotterbolaget Molefutures innovativa ZymeEditor^™ enzymevolution-plattformen har genomfört enzymevolution på T4 DNA-ligas.

Fig 1 Schematiskt diagram över reaktionsprincipen för T4 DNA-ligas^[1]

Fig 2 Struktur för T4 DNA-ligas

Förutom rationell design genomfördes den riktade utvecklingen av T4 DNA-ligas med MTPS-metoden genom att screena stabiliteten, aktiviteten och kvarvarande aktiviteten. Och ett bibliotek på över 10⁴ mutanter screenades. Efter en grundlig analys av mutationsdata valdes lovande kandidater ut för rening och rigorösa tester. Sedan genomgick alla vinnare som erhölls genom rationell design och riktad evolution detaljerad karakterisering efter förfinad rening, omfattande bedömningar av aktivitet, stabilitet, adaptersjälvligering, DNA-fragmentsjälvligering och DNA-utbyte. Baserat på G1-mutanter, laget genomförde DNA-shuffling och kombinerad riktad mutationsdesign för att få exceptionella mutanter som tillgodoser olika tillämpningskrav.

Från mutant till marknadsprodukt med flera omgångar av sekvenseringsvalidering

De ZymeEditor^TM enzymevolution-plattformen har framgångsrikt utvecklat en T4 DNA-ligasmutant med hög termisk stabilitet, högt biblioteksutbyte och låg adaptersjälvligering genom enzymevolutionsteknologi. Det för närvarande förbättrade T4 DNA Ligase har framgångsrikt lanserats - Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Denna produkt överträffar det traditionella T4 DNA-ligaset av vildtyp när det gäller ligeringseffektivitet och termisk stabilitet, och den har verifierats genom sekvensering med hög genomströmning, vilket säkerställer utmärkt kvalitet.

Datapresentation

1. Högre termisk stabilitet

T4 DNA Ligase-mutanter från Yeasen utsattes för värmebehandling vid 42 ℃ under 0, 2 och 4 timmar, och jämfördes med T4 DNA-ligaser från säljare Q, N, A och T.Därefter konstruerades ett helgenom-DNA-bibliotek med användning av 1 µg fragmenterat bovint gDNA med Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) för att jämföra den termiska stabiliteten hos T4 DNA-ligaset.

Fig 3 Termisk stabilitetstest vid 42 ℃

Resultat:

Termisk stabilitet: Yeasen ≈ Leverantör N ≈ Leverantör A > Leverantör T > Leverantör Q.

2. Högre biblioteksutbyte

T4 DNA Ligase-mutanten från Yeasen testades för biblioteksutbyte vid både höga och låga DNA-inmatningsnivåer, jämfört med T4 DNA-ligaser från leverantörer Q, N, A och T. Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) användes, med 1 µg och 0,5 ng av gDNA-konstruerade fragmenterade bibliotek.

Fig 4 DNA-biblioteksutbytesanalys

Resultat:

Bibliotekets avkastning (1 µg gDNA): Yeasen > Leverantör Q ≈ Leverantör T ≈ Leverantör A > Leverantör N. Bibliotekets avkastning (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Leverantör Q ≈ Leverantör A ≈ Leverantör T > Leverantör N.

3.Självligering av den nedre adaptern

T4 DNA-ligasmutanten från Yeasen jämfördes med T4 DNA-ligaser från säljare Q, N, A och T för adaptersjälvligering. Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) användes, med 0 ng och 0,5 ng av fragmenterat bovint gDNA som matades in för att konstruera helgenom-DNA-bibliotek.

Fig 5 Adapter Självligeringsdata med 0 ng (vänster) och 0,5 ng (höger) gDNA-ingång

Resultat:

1) Adapter Self-Ligation Rate (0 ng gDNA): Leverantör N > Yeasen > Leverantör T > Leverantör A > Leverantör Q.

2) Adapterns självligeringshastighet (0,5 ng gDNA): Yeasen > Leverantör T > Leverantör Q ≈ Leverantör N > Leverantör A.

Kontakta oss

Yeasen har framgångsrikt övervunnit begränsningarna hos traditionella T4 DNA-ligaser och erbjuder en T4 DNA-ligasprodukt som utmärker sig i termisk stabilitet, biblioteksutbyte och adaptersjälvligering. I denna process har företaget samlat ett rikt bibliotek av mutanter, vilket ger forskare en mängd olika alternativ för att möta olika experimentella behov. Om du är intresserad av våra produkter eller T4 DNA-ligasmutanter, vänligen kontakta oss genom följande metoder.

E-post: order1@yeasen.com (USA)

Telefon: +1 240-472-6069 (USA)

Yeasen erbjuder dessutom en rad produktserier för T4 DNA-ligas. Klicka på produktlänken för att fråga om produktinformation

Referenser

[1] Shuman S .DNA-ligaser: framsteg och framtidsutsikter[J].Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.