Med den snabba utvecklingen av sidrotein science har proteinreningstekniken en allt viktigare roll inom området för biologisk forskning och bioteknisk industri. Som en kärnteknik involverar det integrering av kodningsinformationen för målproteinet i värdcellerna genom genteknikmetoder, så att de kan induceras att effektivt producera de nödvändiga proteinerna. Därefter utförs en serie sofistikerade in vitro-operationssteg för att uppnå hög renhetsextraktion av proteiner. Proteinrening gör det möjligt för forskare att isolera enskilda typer av proteiner, vilket är avgörande för djupgående studier av proteiners struktur och funktion, utveckling av nya läkemedel, sjukdomsdiagnostik och främjande av tillämpningen av bioteknik. Denna teknik säkerställer inte bara noggrannheten i vetenskapliga experiment utan driver också kontinuerligt utvecklingen av biovetenskap.
Figur 1. Schematiskt diagram av affinitetskromatografi[1]
Inom området för proteinteknik fungerar fusionstaggar som ett kraftfullt verktyg som kan underlätta olika experimentella syften genom att binda till målproteinerna. Funktionerna för vanliga fusionstaggar listas i tabellen nedan för referens. Men när dessa taggar finns kvar på fusionsproteinerna efter att de har uppfyllt sina initiala hjälpfunktioner, kan de ha negativa effekter på efterföljande experiment, såsom att störa immunologiska djurförsök eller påverka proteiners biologiska aktivitet. Därför är det avgörande att ta bort dessa onödiga fusionstaggar för att säkerställa proteinernas normala funktion och experimentens noggrannhet.
Tabell 1. Introduktion till funktionerna hos vanliga fusionstaggar och enzymklyvningsmetoder
| Fusion tag | Storlek (KDa) | Fungera | Vanliga enzymatiska klyvningsmetoder |
| Hans | 0,84 | Fördelaktigt för rening, kan rena lösliga/inklusionskroppsproteiner. | TEV proteas |
| Flagga | 1.01 | Syftet protein sammansmält med Feftersläpning taggen kan kännas igen av antikroppen mot Feftersläpningså att fusionsproteinet som innehåller Feftersläpning taggen kan detekteras och identifieras med Western Blot, ELISA och andra metoder. | Enterokinas |
| moms | 26 | Förbättra proteinlösligheten, kan endast rena lösliga proteiner och skydda toxiska proteiner. | Trombin |
| MBP | 44,4 | Förbättra proteinlösligheten och skyddar giftiga proteiner. | TEV proteas |
| NusA | 55 | Förbättra proteinlösligheten och skyddar giftiga proteiner. | Trombin |
| SUMO | 11.2 | Förbättra lösligheten av proteiner, främja protein från proteolytiska hydrolys och förbättra stabiliteten hos proteiner. | SUMO Protease |
Idag är vi glada över att kunna presentera en spjutspetsprodukt för effektiv och exakt borttagning av fusionstaggar - UCF.METM rTEV proteas. Med sin enkla och lättanvända experimentella procedur kan detta enzym bekvämt klyva onödiga taggar från fusionsproteiner och därigenom erhålla målproteiner med hög renhet.
UCF.METM rTEV proteas
TEV Protease är ett proteas som ofta används för klyvning av rekombinanta proteinfusionstaggar, känt för sin höga platsspecificitet. Den erkänner strikt sju-aminosyror-sekvensen EXXYXQ↓(G/S) och utför exakt klyvning mellan glutamin och glycin eller serin. Den vanligaste sekvensen med sju aminosyror är Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Denna specificitet säkerställer noggrannheten och effektiviteten i proteinbearbetningsproceduren.
Figur 2. Schematiskt diagram över verkningsmekanismen för TEV-proteas[2]
UCF.METM rTEV Protease är ett rekombinant proteas som har genmanipulerats och renats. Det behåller inte bara den fulla funktionella aktiviteten hos det naturliga TEV-enzymet utan uppvisar också utmärkt stabilitet och specificitet över ett bredare temperaturområde. De värd-gDNA-rest av thans produkt är mycket låg, vilket säkerställer högre skärningseffektivitet för proteinfusionstaggar i praktiska tillämpningar och minskar effektivt risken för införande av exogena substansrester. UCF.METM rTEV Protease uppvisar optimal aktivitet under betingelserna pH 7,0 och 30°C. Det upprätthåller dock aktivitet även under ett brett spektrum av förhållanden med pH 6,0-8,5 och temperatur 4-30°C, för att möta de olika proteinbearbetningskraven. Det är värt att nämna att UCF.METM rTEV Protease har en 6×His-tagg vid sin N-terminal, som effektivt kan avlägsnas av Ni-NTA-harts, och därigenom uppnå exakt rening av målproteinet.
Prestandadisplay
1. Hög klyvningseffektivitet: Proteintaggen klyvs mer noggrant
Användning av fusionsproteinet (3 μg) som innehåller UCF.METM rTEV Proteasklyvningsställe som substrat, UCF.METM rTEV-proteas vid 10, 5 respektive 3 U tillsattes och reaktionen utfördes vid 30°C under 1 timme. Klyvningseffekten detekterades genom agarosgelelektrofores. Resultaten visade att Ylättas UCF.METM rTEV Protease kunde klyva substratet effektivt när inmatningsmängden var mer än 3 U, med en klyvningseffektivitet på >90 %.
Figur 3. Verifiering av klyvningsaktiviteten av UCF.METM rTEV proteas
2. Låg värd-gDNA-rester: Minska effektivt risken för införande av exogena substansrester
Genom att testa värden (E. coli) gDNA-rester i olika satser av UCF.METM rTEV-proteas, visade resultaten att värd-gDNA-resten av UCF.METM rTEV Protease var långt under <1 kopia/U.
Figur 4. Resultaten av värd-gDNA-rest i UCF.METM rTEV proteas
3. Breda användningsförhållanden: Kan möta olika proteinbearbetningskrav.
Genom att verifiera klyvningsaktiviteten hos UCF.METM rTEV Protease under olika förhållanden visade resultaten att UCF.METM rTEV Protease hade stark aktivitet under förhållandena 4-30°C, vilket kunde möta kundernas olika applikationskrav.
| Reaktionstid (h) | Klyvningsaktivitet under olika temperaturer (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30 ℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Ylättas rekommenderade fusion tag skärande proteinprodukter
| Produkt Namn | Produkt Numbra | |
| TEV Proteas | UCF.METM rTEV proteas | 20427ES |
| Enterokinas | Enterokinas, rekombinant | 20395ES |
| SUMO Protease | SUMO Protease | 20410ES |
| 3C proteas | 3C proteas | 20409ES |
Referenser:
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Affinity Chromatography[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Pathhamperuma C, Sida R C. Fluorescensdequenching-analys för aktiviteten av TEV-proteas[J]. Analytical biochemistry, 2022, 659: 114954.