RNase HII, även känd som RNase H2, är ett endoribonukleas som specifikt riktar sig mot och bryter fosfodiesterbindningen vid 5'-änden av en ensam ribonukleotid inbäddad i en dubbelsträngad DNA-helix, vilket ger en 5'-fosfat- och en 3'-hydroxylgrupp (Fig. hydroxylgrupp). Detta enzym uppvisar minimal klyvningsaktivitet mot enkelsträngat RNA och är inaktivt mot både dubbelsträngat DNA (dsDNA) och enkelsträngat DNA (ssDNA). Funktionellt aktiv inom temperaturområdet 50°C till 75°C, når RNase HII toppprestanda vid temperaturer mellan 70°C och 75°C. Genom att utnyttja sin unika förmåga att utföra riktad klyvning på ett ställe på DNA-ställen där en ribonukleotid är integrerad, utan att påverka dsDNA eller ssDNA, fungerar RNase HII som en precisions "trigger" för reaktionsinitiering, inklusive primeraktivering och -förlängning, för att uppnå specifik amplifiering. Detta enzym spelar en avgörande roll i RNas H-beroende PCR (rhPCR), loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP) teknologi och nedbrytningen av RNA-komponenter i Okazaki-fragment.

一. RNas H-beroende PCR(rhPCR)
rhPCR inkorporerar RNase HII och specialdesignade, slutna klyvbara rhPCR-primrar i PCR-processen. Detta tillvägagångssätt utnyttjar den unika egenskapen hos RNase HII för att selektivt hydrolysera RNA i DNA-RNA-hybrider, samtidigt som fosfodiesterbindningarna i enkelsträngat eller dubbelsträngat DNA och RNA lämnas intakta. Som ett resultat smälter RNase HII endast DNA-RNA-hybriden och tillåter primerförlängning när primern är perfekt komplementär till mål-DNA-sekvensen. Denna riktade åtgärd förbättrar reaktionens noggrannhet avsevärt. RNase HII är det enda enzymet som kan initiera det exakta avlägsnandet av ribonukleotider utan att inducera mutationer genom att klyva i 5'-änden av ribonukleinsyra. På grund av sin höga specificitet, känslighet och reproducerbarhet erbjuder rhPCR distinkta fördelar i tillämpningar som detektion av singelnukleotidpolymorfism (SNP), gentypning, samtidig detektering av flera mål och miljönukleinsyraanalys.

Teknisk väg

1. Primer Design

Primerdesign måste säkerställa att smälttemperaturen efter skärning är högre än glödgningstemperaturen för att säkerställa att primern stabilt binder till mallen under PCR-cykler. rhPCR-primern består av tre delar:

1）5' DNA-segment: Jämförbara i längd och smälttemperatur (Tm) krav med standard PCR-primers, kan det effektivt paras ihop med och sträcka sig från mall-DNA efter att ha klippts av RNase HII-enzym.

2) En enda RNA-bas: tillhandahåller ett skärställe för RNas HII.

3）3'-DNA-segment: En längd av fyra eller fem baser med en blockerare, vanligtvis en kort, icke-förlängningsbar molekyl som propylenglykol, som förhindrar förlängning av DNA-polymeras tills blockeraren tas bort.

2. Skärning och förlängning

I början av rhPCR-reaktionen är primer- och mall-DNA fria. När primern binder till den specifika RNA:DNA-heteroduplexmallen, känns RNA-basens 5'-sida av den blockerade primern igen och skärs av RNase HII-enzymet, vilket lämnar en DNA-oligonukleotid med en 3'-hydroxylgrupp, vilket ger en startpunkt för DNA-polymeras att förlänga. Detta följs av den konventionella PCR-amplifieringsprocessen.

Fig 2. Diagram över rhPCR-principen ^[1]

二.Loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP)

Loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP) är en enkel och snabb metod för genamplifiering som kan amplifiera nukleinsyror under isotermiska förhållanden på kort tid. På grund av initieringen av DNA-polymerasaktivitet under beredningen vid rumstemperatur bildas emellertid icke-specifika felparningar, vilket kan leda till en liten mängd felparning och primerdimerer, vilket orsakar mindre kontaminationer som kan resultera i falska positiva resultat.
Att applicera RNase HII på LAMP-förstärkningssystemet kan effektivt lösa problemet med falska positiva resultat i LAMP-teknologin, vilket breddar dess tillämpning inom klinisk diagnostik. Som visas i fig 3, den primeraktiverade LAMP-metoden (PA-LAMP) med RNase HII, när primern parar sig med mål-ssDNA:t, klyver RNase HII-enzymet specifikt RNA:t på primern, aktiverar det och tillåter primerförlängning, uppnår specifik amplifiering och effektivt reducerar det falska systemet.

YEASEN RNase HII

YEASENs RNase HII (Katt#14539) härrör från Pyrococcus abyssi, Pa, och det är fritt från kontaminerande nukleaser, nicking-enzymer och RNas-rester, med låg värd-DNA-kontamination, vilket effektivt minskar falska positiva resultat i systemet. YEASENs RNase HII är extremt värmebeständig, behåller sin aktivitet även efter 30 minuter vid 95°C, vilket gör den kompatibel med olika rhPCR-reaktionssystem och även lämplig för LAMP och andra applikationer.

1. E. coli genomisk DNA-rest < 0,5 kopior/100 U

Detektering av E. coli genomisk DNA-rest i olika partier av RNase HII visade att värdgenomisk DNA-rest av YEASENs RNase HII är långt under 0,5 kopior/100 U.

Fig 4. Detektering av E. coli genomisk DNA-rest

2. 95°C värmebeständighetstest

Efter upphettning av RNase HII vid 95°C under 0 till 45 minuter testades enzymaktiviteten hos RNase HII. Resultaten visade att det nästan inte fanns någon förlust av enzymaktivitet i YEASENs RNase HII ens efter 45 minuters uppvärmning.

Fig 5. 95°C värmebeständighetstest

3. Inget exonukleas., Nicking-enzym eller RNas-rester (1 U-dos)

Inkubering av 1 U av olika satser av RNas HII med deras respektive substrat DNA/RNA vid 37°C under 4 timmar, visade resultaten av agarosgelelektrofores att det inte fanns något exonukleas, nicking-enzym eller RNas-rest i RNas HII.

Fig 6.Detektionsresultat av exonukleas, nicking-enzym och RNas-rest

Rekommenderade relaterade produkter

Produktapplikation	Produktnamn	Katalognummer
rhPCR, LAMPA	RNase HII(2 U/μL) RNase HII, glycerolfri (2 U/μL)	14539ES 14541ES
rhPCR	Hieff® Taq DNA-polymeras	10101ES
RT-LAMPA	Hieff® Bst Plus DNA-polymeras (40 U/μL)	14402ES
	Hifair® Ⅲ Omvänt transkriptas	11111ES

Referenser

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. RNas H-beroende PCR (rhPCR): förbättrad specificitet och detektion av enkelnukleotidpolymorfism med användning av blockerade klyvbara primrar. BMC Biotechnol. 2011 10 aug;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. Enkelstegs, högspecificitetsdetektion av enkelnukleotidmutation genom primeraktiverbar loop-medierad isotermisk amplifiering (PA-LAMP)[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.