Figur 1. Schematiskt diagram av DNas I-klyvande dsDNA i närvaro av Mg²⁺ och Mn²⁺

Vanligt DNas I renas primärt från bovin pankreas eller är ett rekombinant enzym. Jämfört med DNas I renat från bovin bukspottkörtel, har rekombinant DNas I relativt lägre endogena RNas-nivåer eller kan formuleras som RNas-fria produkter, vilket gör det mer lämpligt för RNas-känsliga tillämpningar, såsom avlägsnande av DNA från RNA-prover.

Ansökningar

När det gäller applikationer är DNas I välkänt för dess användning i experiment relaterade till att bibehålla RNA-integritet, såsom extrahering av RNA fritt från DNA, framställning av RNA-mallar utan gDNA före omvänd transkription och nedbrytning av DNA-mallar efter in vitro-transkription. Dessutom kan den användas för att smälta DNA-sonder vid rRNA-borttagning, för DNA-märkning genom nick-translation, analysera DNA-protein-interaktioner med användning av fotavtrycksmetoden, generera slumpmässiga DNA-bibliotek, reducera viskositeten hos cellysat eller proteinextrakt, smälta cellvidhäftningar som tillsats i cellkultur och delvis kontroll av genomisk DNA-analys som positiv DNA-analys. apoptosdetektering. Sammanfattningsvis kan DNas I användas i nästan alla tillämpningar som kräver enzymatisk nedbrytning av DNA. Nedan ges en kort introduktion till flera vanliga applikationer.

• Avlägsnande av gDNA före RNA-extraktion eller omvänd transkription

RNA, som ett vanligt studerat prov i laboratorier, påverkar i hög grad kvaliteten på experimentella data på grund av dess egen kvalitet. Det är i allmänhet omöjligt att helt undvika resterna av gDNA under RNA-extraktionsprocessen. Innan man utför utmanande nedströmsapplikationer (såsom mRNA-expressionsanalys, transkriptomanalys, etc.), rekommenderas det därför vanligtvis att behandla RNA-prover med DNas I för att smälta kvarvarande gDNA. Nedbrytningen av gDNA kan utföras under RNA-extraktion, efter RNA-extraktion eller före RNA-omvänd transkription.

Figur 2. DNas I-baserad gDNA-borttagningsprocess

• Avlägsnande av mall-DNA i in vitro-transkription

In vitro-transkription (IVT) använder primärt DNA som mall för att producera RNA under påverkan av lämpliga substrat och buffertar. Vanligt använda RNA-polymeraser i denna process inkluderar T7, T3 och SP6, som är ansvariga för att katalysera RNA-syntes. Den syntetiserade RNA-produkten kan dock innehålla DNA-rester, och att eliminera dessa rester är fördelaktigt för experiment nedströms.

Särskilt i utvecklingsprocessen av mRNA-vacciner är avlägsnandet av dessa DNA-rester ett kritiskt steg som direkt påverkar svårigheten med efterföljande reningsprocesser och renheten hos slutprodukten.För att effektivt eliminera mall-DNA används DNas I vanligtvis för behandling för att säkerställa att RNA-provet är fritt från DNA-rester, ett steg som hjälper till att förbättra experimentets övergripande noggrannhet och effektivitet.

Figur 3: In vitro-transkriptionsprocess med användning av linjäriserad plasmid som mall^[4]

• rRNA-borttagning i RNA-bibliotekskonstruktion och -sekvensering

I organismer är rRNA mycket rikligt och mycket konserverat, vilket är av liten betydelse för att få fram biologisk informationsforskning. Emellertid är 95 % av det totala RNA som extraheras under experiment humant rRNA, och närvaron av dessa rRNA kan störa detektionen av mål-RNA. Därför, vid beredning och sekvensering av RNA-bibliotek, tas rRNA vanligtvis bort först. För närvarande är den huvudsakliga metoden för avlägsnande av rRNA RNAas-spjälkning, och dess huvudsakliga funktion steg och principer är följande:

1. Extrahera totalt RNA;
2. Hybridisera enkelsträngade DNA-sonder med rRNA-molekyler (Notera: Designa och syntetisera rRNA-specifika enkelsträngade DNA-sonder);
3. RNas H bryter ned det hybridiserade rRNA;
4. DNas I bryter ned DNA-sonderna;
5. rRNA avlägsnas framgångsrikt och lämnar efter sig icke-rRNA RNA-mallar.

Figur 4: Schematiskt diagram av rRNA-borttagningsprincipen baserat på enzymatisk metod^[5]

• Nick-översättning för DNA-märkning

Nick translation är den mest använda metoden för att märka deoxiribonukleinsyrasonder i laboratoriet. Denna metod uppnås genom den kombinerade verkan av DNas I och E.coli DNA-polymeras I.

Huvudprincipen är följande:

1. Använd först en lämplig koncentration av DNas I för att skapa flera enkelsträngade hack i varje sträng av det dubbelsträngade DNA som ska märkas, vilket bildar 3'-hydroxylterminaler vid hackställena.
2. Använd sedan 5'→3' exonukleasaktiviteten av coliDNA-polymeras I för att avlägsna en nukleotid från 5'-änden av hacket, medan 5'→3'-polymerasaktiviteten hos E. coli DNA-polymeras I introducerar en märkt nukleotid till 3'-änden av hacket för att reparera den. När hacket rör sig längs DNA-strängen, inkorporeras de märkta nukleotiderna i den nyligen syntetiserade DNA-strängen.

Figur 5: Schematiskt diagram av principen för DNA-märkning genom nick-translation^[6]

• DNas I-footprinting-analysexperiment

DNase I-footprinting-analysen är en exakt metod för att identifiera bindningsställena för DNA-bindande proteiner på DNA-molekyler. Principen är att proteiner bundna till ett DNA-fragment skyddar den bundna regionen från att brytas ned av DNas I. Efter enzymatisk digestion kan det återstående fragmentet ("fotavtrycket") användas för att bestämma dess sekvens. I gelbilden finns det inga band som motsvarar de regioner där proteinet är bundet.

Huvudprincipen är följande:

1. Märk de enkelsträngade ändarna av den dubbelsträngade DNA-molekylen som ska testas.
2. Blanda proteinet med DNA och tillsätt en lämplig mängd DNas I för enzymatisk nedbrytning och bildar DNA-fragment av varierande längd.Mängden enzym bör kontrolleras för att säkerställa att intilliggande DNA-fragment skiljer sig med endast en nukleotid, och en kontroll utan tillsatt protein bör inkluderas parallellt.
3. Ta bort proteinet från DNA:t, separera det denaturerade DNA:t genom PAGE-elektrofores och autoradiografera för att tolka nukleotidsekvensen för fotavtrycksregionen genom jämförelse med kontrollgruppen.

Figur 6: Schematiskt diagram över principen för DNas I-footprinting-analys^[7]

De DNas I Urvalsguide för Yeasen

För att möta olika applikationsbehov erbjuder Yeasen rekombinant DNas I i E. colioch kan tillhandahålla DNas I av GMP-grad för att uppfylla kraven för mRNA in vitro-transkription och andra tillämpningar.

Produktpositionering	Ansökan	Produktnamn	katalognummer
RNase fri	ta bort DNA från RNA och proteinberedningar	Rekombinant DNas I (RNas-fri)	10325ES
GMP-klass, RNase fri	In vitro-transkription av mRNA	UCF.ME® deoxiribonukleas I (DNas I) GMP-kvalitet	10611ES

Referenser

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV-DNA, E6/E7 mRNA och p16INK4a-detektion i huvud- och halscancer: en systematisk översyn och metaanalys [J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Jämförelse av onkogen HPV-typspecifik virus-DNA-belastning och E6/E7-mRNA-detektion i cervikala prover: resultat från en multicenterstudie [J]. Journal of Medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimering av Dnas I-borttagning av kontaminerande DNA från RNA för användning i kvantitativ RNA-PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Framsteg av in vitro-transkriberat mRNA (IVT-mRNA) för att möjliggöra översättning till klinikerna[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Irreversibel värmeinaktivering av DNas I utan RNA-nedbrytning[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. In situ nick translation av metafaskromosomer med biotinmärkt d-UTP[J]. Human genetics, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Att välja en lämplig metod för identifiering av replikationsursprung i mikrobiella genom. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.