Deoxiribonukleas I (DNas I) är ett endonukleas, dess tillämpning är inte bara för att upprätthålla RNA-integritet utan även för DNA-fotavtrycksanalys, generering av slumpmässiga DNA-bibliotek, minskning av klibbighet i cellysat eller proteinextrakt, etc. Kort sagt, DNas I kan användas i nästan alla tillämpningar som kräver enzymklyvning av DNA. Följande är en detaljerad introduktion till DNas I och dess specifika tillämpning.

1. Vad är DNase I?
2. DNas I för framställning av DNA-fri RNA-extraktion
3. DNas I för in vitro-transkription för att avlägsna mall-DNA
4. DNas I för rRNA-borttagning
5. DNas I för DNA-märkning
6. Andra tillämpningar
7. DNase I produktvalsguide

1. Vad är DNase I?

Deoxiribonukleas I (DNas I) är ett ospecifikt endonukleas som kan smälta enkel- eller dubbelsträngat DNA, som finns i olika vävnader och kroppsvätskor. Det kan hydrolysera fosfodiesterbindningar för att producera mono- och oligodeoxinukleotider som innehåller en 5'-fosfatgrupp och en 3'-OH-grupp. Det optimala arbets-pH-intervallet för DNas I är 7-8, dess aktivitet beror på Ca2+ och kan aktiveras av tvåvärda metalljoner såsom Mn2+, Mg2+, Zn2+, etc. I närvaro av Mg2+, klipper DNas I slumpmässigt vilken plats som helst av dubbelsträngat DNA; i närvaro av Mn2+ kan DNas I klippa DNA dubbelsträngat på samma ställe för att bilda en trubbig ände eller en 1-2 nukleotiders klibbiga ändar överhänger.

Figur 1. Schematiskt diagram över klyvningen av dsDNA med DNas I i närvaro av Mg2+ och Mn2+.

Även om DNas I-klyvningar generellt anses vara icke-specifika klyvningar, är det mer sannolikt att DNas I agerar på vissa sekvensfragment, såsom minor groove-regionen, och är mer benägen för klyvningar av purin-pyrimidinsekvenser. Men när DNas I verkar på heterogent dsDNA kommer alla fyra baserna att klyvas, och effekten på en specifik bas kommer inte att vara mer än 3 gånger större än den för andra baser.

2. DNas I för framställning av DNA-fri RNA-extraktion

I biologiska experiment är det första steget att förbereda nukleinsyra för att studera olika funktioner hos RNA. Men eftersom DNA och RNA ofta frisätts tillsammans under cellyseringsprocessen, kan interferensen i de två inte undvikas oavsett vilken extraktionslösning som används, så specifika enzymer måste användas för att ta bort interferensen. För högkvalitativ RNA-extraktion används DNas I för att avlägsna resterande DNA från provet.

DNas I kan bryta ned dubbelsträngat och enkelsträngat DNA till oligonukleotider och enkla nukleotider, och DNA:t i RNA-beredningsprodukten kan effektivt brytas ned. DNas I inaktiveras sedan genom uppvärmning med en stoppbuffert. Under uppvärmningsprocessen kan hårnålsstrukturen hos RNA-molekylen öppnas, vilket underlättar det direkta inträdet av RNA:t i den omvända transkriptionsprocessen.
Kvaliteten på RNA kommer att direkt påverka experimentdata i stor utsträckning. I allmänhet kan gDNA-rester inte helt undvikas under RNA-extraktion, därför rekommenderas det i allmänhet att behandla RNA-prover med DNas I för att smälta kvarvarande gDNA innan man utmanar nedströmsapplikationer (t.ex. mRNA-expressionsanalys, transkriptomanalys, etc.). Steget att smälta gDNA kan utföras under RNA-extraktion, efter RNA-extraktion eller före RNA-omvänd transkription.Enligt produktpositioneringen är produkterna som tillhandahålls av Yeasen följande:

Tabell 1: Lista över produkter relaterade till DNA-borttagning av RNA-extraktion eller före omvänd transkription

3. DNas I för in vitro-transkription för att avlägsna mall-DNA

In vitro-transkription (IVT) använder huvudsakligen DNA som mall, plus motsvarande substrat och buffertar för att erhålla RNA genom in vitro-transkription. I in vitro-transkriptionsexperiment används vanligtvis RNA-polymeraser som T7, T3 och SP6 för RNA-syntes. Det syntetiserade RNA:t kan ha DNA-rester. Att eliminera DNA-resterna är fördelaktigt för utvecklingen av nedströmsexperiment. Till exempel, i utvecklingsstadiet för mRNA-vaccin, är avlägsnandet av rester ett kritiskt steg, vilket kan minska svårigheten med nedströmsrening och öka produktens renhet. DNA-mallen avlägsnas vanligtvis med användning av rekombinant DNas I (RNas-fri).Enligt mRNA-syntesprocessen är produkterna som tillhandahålls av Yeasen följande: