Omvänt transkriptas, även känt som RNA-beroende DNA-polymeras, är ett DNA-polymerasenzym som transkriberar enkelsträngat RNA till DNA. Prestandan hos omvänt transkriptas kommer att direkt påverka den slutliga prestandan för molekylärdiagnostiska reagenser. Som svar på smärtpunkterna hos tillverkare av molekylärdiagnostiska reagenser har Yeasen genomfört riktningstransformationen på omvänt transkriptas. Omvänt transkriptas har utmärkt prestanda och tas väl emot av kunderna!

1. Vilken funktion har omvänt transkriptas?
2. Hur väljer man omvänt transkriptas?
3. Varför välja Yeasens omvända transkriptas?
4. Relaterade produkter och prestanda
5. Relaterade produkter

1. Vilken funktion har omvänt transkriptas?

Omvänt transkriptas är ett RNA-beroende DNA-polymeras. Det kan transkribera mall-RNA:t och bildar komplementärt DNA (cDNA). Enkelsträngat cDNA omvandlas till dubbelsträngat DNA med hjälp av DNA-polymeras. Så omvända transkriptaser används vanligtvis för att kvantifiera nivån av mRNA-syntes när de kombineras med polymeraskedjereaktionstekniken, kallad RT-PCR. Kvantitativa RT-PCR-analyser används vanligtvis vid sjukdomsdiagnostik. Därför spelar omvänt transkriptas en viktig roll i vetenskaplig forskning och praktisk tillämpning.

2. Hur väljer man omvänt transkriptas?

Vanliga omvända transkriptaser är M-MLV och AMV, bland vilka M-MLV är bättre än AMV. Men konventionella RT-enzymer har två aktiva ställen, en som utför polymerasaktiviteterna och en annan som utför ribonukleas H-aktiviteten. RNase H är ett endonukleas som kan bryta ner RNA-delen av DNA-RNA-hybridfamiljen. Därför är omvänt transkriptas som saknar RNas H-aktivitet fördelaktigt för cDNA-syntes. Dessutom är det fördelaktigt att använda en termostabil version av RT för att sänka den ospecifika nukleinsyraamplifieringen och minimera effekten av komplexa sekundära strukturer.

3. Varför välja Yeasens omvända transkriptas?

Yeasen har utfört riktad modifiering på omvänt transkriptas, vilket tar bort RNas H-aktivitet, och därigenom förbättrar förmågan för cDNA-syntes. Använder proteinutvecklingsteknologi för att förbättra termostabiliteten för omvänd transkription.

Yeasens omvända transkriptas har inte bara en stark syntesförmåga utan också en stark toleransförmåga. Dessutom har Yeasen höga krav på kvalitet. Det är det bästa valet för omvänt transkriptas.

4. Relaterade produkter och prestanda

4.1 Beständig mot höga temperaturer på 65°C

Med användning av 500 ng 293T-cell totalt RNA som mall utfördes omvänd transkription vid 42°C-65°C med användning av Hifair™ Ⅲ omvänt transkriptas. Ta 1 μL cDNA som mall för att amplifiera TFRC-genen (4,4 kb).

Figur 1. Utför omvänd transkription vid 42°C-65℃

4.2 Kompatibel med komplexa mallar

Reaktionstemperaturen på 55°C kan tillfredsställa den omvända transkriptionen av konventionella mallar och sekundära strukturmallar, och reaktionstemperaturen för mallar med hög GC kan lämpligen höjas till 65°C.

Figur 2.Lämplig för GC-rika mallar och sekundära strukturmallar

4.3 Utmärkt förlängningsprestanda

Med användning av 500 ng totalt RNA från 293T-celler som en mall och Oligo(dT) som en primer, syntetiserades cDNA med hjälp av Hifair™ Ⅲ omvänt transkriptas. Ta 1 μL cDNA som mall för att amplifiera 500 bp av 5' av DY1C1N1-genen (19,9 kb). Resultaten visade att Hifair™ Ⅲ omvänt transkriptas kan syntetisera cDNA upp till 19,8 kb.

Figur 3. Upp till 19,8 kb cDNA kan syntetiseras

4.4 Snabb syntes

Med användning av RNA från 293T-celler som mall utfördes omvänd transkription enligt standardproceduren i manualen, och omvänd transkriptionstiden ställdes in enligt 5, 10, 15, 30, 45 respektive 60 minuter. Hifair™ III omvänt transkriptas kan syntetisera ett 6 kb cDNA inom 5 minuter, och dess specificitet och utbyte är överlägsna de för varumärket V.

Figur 4. 6 kb cDNA kan syntetiseras inom 5 minuter

4.5 Brett linjärt område

Med användning av 5pg-5μg totalt RNA från 293T-celler som mall, syntetiserades cDNA med Hifair™ III omvänt transkriptas. 1 μL cDNA användes som mall och qPCR utfördes på de fyra generna, och resultaten visade att amplifieringseffektiviteten var mellan 98 % och 100,10 %. Det visar att cDNA effektivt kan syntetiseras i ett brett linjärt utbud av mallar.

Figur 5. cDNA kan syntetiseras effektivt inom ett brett mallområde

4.6 Strikt kvalitetskontroll

För att säkerställa en stabil prestanda för Yeasens omvända enzym, implementerar Yeasen strikt kraven i produktionsprocessen för att stabilisera produktionsprocessen och säkerställa batchstabilitet. Samtidigt förstärks kvalitetskontrollen för att upptäcka rester inklusive exonukleas, nickas, RNas, etc., för att se till att det inte finns några rester för att inte påverka nedströmsförsök.

Figur 6. Restdetektering

5. Relaterade produkter

Produkterna som tillhandahålls av Yeasen är följande.

Tabell 1. Relaterade produkter

Angående läsning

Riktlinjen för val av omvänt transkriptas

YEASEN UDG: "antifouling-experten" i PCR-reaktioner