Vilka enzymer använder forskare för att binda en ny gen? Naturligtvis ingår DNA-ligas. Så varför är DNA-ligas så viktigt i rekombinant DNA? Eftersom DNA-ligas är ansvarigt för att ligera målfragmentet till vektorn, vilket är ett av nyckelelementen som avgör experimentets framgång. Som ett slags DNA-ligas, vilken roll spelar T4 DNA-ligas i molekylära kloningsexperiment? Hur fungerar det? T4 DNA-ligaset kommer att introduceras grundligt härnäst.

1. Vad är T4 DNA-ligas?
2. Vilken funktion har T4 DNA-ligas?
3. Yeasen Biotech T4 DNA-ligas kan användas för NGS-adapterligering
4. En urvalsguide för Yeasen Biotech T4 DNA-ligas

1. Vad är T4 DNA-ligas?

T4 DNA-ligas är ett ATP-beroende ligas som katalyserar ligeringsreaktionen mellan DNA-molekyler. Den bildar huvudsakligen fosfodiester genom att länka 3'-hydroxyl- och 5'-fosfatändarna. DNA-ligaser är involverade i DNA-replikation och reparationsprocesser i alla organismer. Det fagkodade T4 DNA-ligaset produceras under fag T4-infektion av E. coli.
De ligaser som används inom genteknik är huvudsakligen E. coli DNA-ligas och T4 DNA-ligas, varvid det senare används i större utsträckning för närvarande. T4 DNA-ligas kan reparera enkelsträngade hack på dubbelsträngat DNA, dubbelsträngat RNA eller DNA/RNA-hybridsträngar för att koppla samman två intilliggande nukleotider, och spelar en viktig roll i DNA-reparation och rekombination.
I den rekombinanta plasmidkonstruktionsprocessen kan T4 DNA-ligas användas tillsammans med restriktionsenzymer för att fullborda det rekombinanta plasmidkonstruktionsexperimentet. Det kan katalysera bildningen av en fosfodiesterbindning mellan 5'-P-änden och 3'-OH-änden av dubbelsträngat DNA och har en god anslutningseffektivitet för klibbiga ändar och trubbiga ändar.

Figur 1. T4 dna-ligasmekanism

2. Vilken funktion har T4 DNA-ligas?

2.1 Vektorkonstruktion

I vektorkonstruktionsexperiment kan olika restriktionsenzymer producera olika typer av ändar. För olika ändar kommer T4 DNA-ligas att ha olika ligeringsstrategier.

2.1.1 Kloning med restriktionsenzymer, klibbiga ändar som produceras genom enkel smältning

Under konstruktionen av vektorn, om samma restriktionsendonukleas används för att skära DNA-fragmentet av målgenen och vektormolekylen kan producera samma klibbiga ände, kan T4 DNA-ligaset direkt utföra rekombinationskopplingen. Men eftersom de klibbiga ändarna är desamma kan målgenen infogas i vektorn i framåt- eller bakåtriktningen, vilket lätt kommer att öka arbetsbelastningen för screening för korrekta rekombinanta kloner. Överväg att använda digestionsmetoden med dubbla enzymer för vektorkonstruktion.
Dessutom kan de kohesiva ändarna av vektorn som framställts genom enstaka enzymdigestion också paras, och sedan bildas fosfodiesterbindningar mellan nukleotider under verkan av T4 DNA-ligas, vilket resulterar i självligering av vektorn. Användning av alkaliskt fosfatas för att behandla den digererade vektorn kan avlägsna fosfatgruppen vid 5'-änden av vektorn så att vektorn inte kan fullborda självligeringen. Under verkan av T4 DNA-ligas är sålunda vektorn och målfragmentet anslutna för att fullborda konstruktionen av den rekombinanta vektorn.

2.1.2 Kloning med restriktionsenzymer, klibbiga ändar producerade genom dubbelsmältning

I processen för vektorkonstruktion, om två restriktionsenzymer med olika klibbiga ändar används för att smälta målfragmentet respektive vektorn, kan två olika klibbiga ändar genereras. Vid denna tidpunkt kan T4 DNA-ligas selektivt ligera samma klibbiga ändar för att säkerställa att målfragmentet infogas i vektorn i rätt riktning. När målfragmentet och vektorn i figur 2 digereras med EcoRI och BamHI samtidigt, kan samma klibbiga ändar kopplas samman. Det finns bara en ligeringsriktning mellan målfragmentet och vektorn.

Figur 2. Sticky end ligering genererad av dubbel-enzym digestion^[1]

2.1.3 Kloning av restriktionsfragment, trubbig ände

Vissa restriktionsendonukleaser kan också generera trubbiga ändar under enzymatiska klyvningar, såsom Smal och andra. T4 DNA-ligas kan direkt bilda en fosfodiesterbindning mellan vektorn och insatsen, och det finns inget behov av parning mellan baser. Emellertid har denna metod låg ligeringseffektivitet och är benägen till vektorsjälvligering. I allmänhet kan de trubbiga ändarna omvandlas till klibbiga ändar och sedan ligeras. Till exempel, tillsats av komplementära poly A- och poly-T-baser till ändarna av målfragmentet och vektorn och artificiellt klibbiga komplementära ändar respektive förbättrar kopplingseffektiviteten genom terminalt deoxinukleotidyltransferas.

2.1.4 TA-kloning

T-vektorn som används vid TA-kloning har ett T-överhäng vid 3'-änden. När DNA-sekvensen för målfragmentet är oklar kan målgenfragmentet kopplas till T-vektorn genom TA-kloning och målgenen kan bestämmas genom sekvensering. Taq DNA-polymeraset som används i PCR har terminal transferasaktivitet och kan lägga till en nukleotid "A" till 3'-änden av DNA-fragmentet. T4 DNA-ligas kan direkt koppla produkten som amplifierats av Taq DNA-polymeras till T-vektorn, och den PCR-amplifierade produkten kan uppnå syftet med effektiv kloning utan att lägga till artificiella adaptrar.

Figur 3. Arbetsflödet för TA-kloning^[2]

2.2 NGS-adapterligering

Under konstruktionen av nästa generations sekvenseringsbibliotek är det nödvändigt att ansluta den artificiella adaptern till PCR-produkten innan den kan fixeras på flödescellen på sekvenseringschippet för att slutföra sekvenseringen. Byggande av TA-kloningsligeringslinkerbibliotek är ett mycket vanligt tekniskt sätt, och dess princip liknar den ovan nämnda TA-kloningen. Efter att DNA-fragmentet som ska sekvenseras är fosforylerat vid 5'-änden och "A" tillsatts vid 3'-änden, är det komplementärt och parat med adaptern med den "T"-klibbiga änden. Den fullständiga dubbelsträngen formas sedan och sekvenseras av maskinen.
Under TA-ligering kommer olika provtyper eller komplexiteten hos nukleinsyrafragmentstrukturen att påverka effektiviteten av ligeringen, så adaptrarna på olika plattformar kommer också att ha en inverkan på det slutliga biblioteksresultatet.
Till exempel har Bubble-adaptern på MGI-plattformen en speciell sekundär struktur och kräver mycket hög ligeringseffektivitet för T4 DNA-ligas, och minskningen av ligeringseffektiviteten påverkar direkt utdata från biblioteket.

Figur 4. Allmän adapterligeringsprocess

3.Yeasen Biotech T4 DNA-ligas kan användas för NGS-adapterligering

Yeasen Biotech speciellt utvecklad Snabbt T4 DNA-ligas för ligering av DNA-fragment och adaptrar i processen för NGS-bibliotekskonstruktion. Enzymet har effektiv ligeringsförmåga, inte bara snabb anslutningshastighet utan också kompatibel med olika typer av prover, vilket är mer fördelaktigt för sammankoppling av nukleinsyrafragment med komplexa strukturer. För närvarande har det verifierats genom högkapacitetssekvensering av ett stort antal kunder. För anslutning av Bubble-adaptrar på MGI-plattformen kan även utmärkt sekvenseringskvalitet erhållas.

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA-ligas med ultrahög ligeringseffektivitet

Använd Yeasen Biotech Fast T4 DNA-ligas för att konstruera bibliotek med olika adaptertyper. Provet är en 170 bp cfDNA-mimik och Agilent 2100-biblioteket används för att detektera resultaten. ①Oansluten adapterprodukt; ②Singel-ände adapterprodukt; ③ Adapterprodukt med dubbla ändar; ④Resterad adapter. Av resultaten kan det ses att ligeringseffektiviteten för enkeländade och dubbeländade adaptrar är mycket hög.

Figur 5. Olika typer av ligeringsprodukter detekterade av Agilent 2100

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA-ligas med utmärkt biblioteksutbyte

Genom att använda Fast T4 DNA-ligas för olika typer av bibliotekskonstruktion, jämfört med andra T4 DNA-ligaser, är biblioteksutbyten bättre.

Tabell 1. Bibliotekens avkastning av olika typer av prover

4. En urvalsguide för Yeasen Biotech T4 DNA-ligas

Yeasen är ett bioteknikföretag som är engagerat i forskning, utveckling, produktion och försäljning av tre viktiga biologiska reagenser: molekyler, proteiner och celler. Förutom Fast T4 DNA-ligas har Yeasen Biotech även Nytt T4 DNA-ligas och Snabb T4 DNA-ligas att välja mellan. Du kan välja dem baserat på applikationer som visas i följande tabell:

Tabell 2: Relaterade produkter

Referenser

[1] W. Yuan. Genteknik[M]. Chemical Industry Press, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee MR. Kloning av gener för syntetisk biologi - ScienceDirect[J]. Molecular Biology (tredje upplagan), 2019:199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. DNA-ligaser: struktur, reaktionsmekanism och funktion[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. DNA-ligaser: framsteg och framtidsutsikter[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.