Med den snabba utvecklingen av glykoproteomik och antikroppsläkemedelsforskning har glykosyleringsmodifiering också väckt stor uppmärksamhet. Kontakten mellan celler och celler, och mellan celler och patogener fullbordas huvudsakligen genom interaktion mellan socker och proteiner, och glykosylering bestämmer vidhäftningsegenskaperna hos glykokonjugat. I IgG är den konserverade N-kopplade glykosyleringen vid Asn297 i Fc-regionen också avgörande för dess aktivitet. Vissa antikroppar har dessutom ytterligare N-glykaner, som tillsammans med det konserverade stället vid Asn297 i Fc-regionen påverkar antikroppens igenkänning, halveringstid och immunsvar.
Proteinglykosylering är en komplex post-translationell modifiering som involverar kopplingen av glykankedjor på specifika platser på proteiner. Beroende på typen av glykankedja delas glykoproteiner in i N-länkade glykoproteiner, O-länkade glykoproteiner, etc.; dessutom påverkas proteinglykosylering också av värdcellstypen och fermentationsförhållandena (såsom odlingsmedium, pH-värde, temperatur, etc.). Därför har glykoproteiner vanligtvis heterogenitet i glykosyleringsmönster, inklusive glykosyleringsställen, glykosyleringsnivåer och den specifika strukturen av glykankedjor, vilket gör glykankedjeanalys och strukturell karakteriseringsarbete extremt utmanande. För att erhålla den maximala mängden glykankedjestrukturinformation är huvudstrategin för glykankedjeanalys att först frigöra glykankedjorna från proteinerna och sedan utföra detaljerad analys och karakterisering. I denna strategi är en effektiv, exakt och stabil deglykosyleringsmetod avgörande.
Enzymatiska metoder används för närvarande i stor utsträckning för deglykosylering.
Glykoproteiner kan klassificeras i N-länkade och O-länkade glykopeptider baserat på deras typer av glykankedjor. För N-länkade glykopeptider inkluderar vanliga enzymer peptid N-glykosidas F (PNGas F), endoglykosidas H (Endo H) och endoglykosidas S (Endo S). PNGase F hydrolyserar GlcNAc-Asn-bindningen och kan ta bort höga mannos-, komplex- och hybridglykankedjor. Endo H klyver glykosidbindningar inom N-glykankedjans pentasackaridkärna. Endo S klyver specifikt N-länkade glykaner från chitobioskärnan i den tunga kedjan av naturligt IgG.
Bild 1. Skärplats för PNGase F, Endo H och Endo S.
Bland dem, PNGase F är den mest effektiva enzymatiska metoden för att ta bort nästan allt N-kopplat oligosackarider i glykoproteiner, som kan klyva högmannos-, hybrid- och komplexa oligosackaridglykoproteiner kopplade till asparagin, vilket specifikt tar bort N-länkade glykaner. Klyvningsstället är: amidbindningen mellan den innersta N-acetylglukosaminen (GlcNAc) och asparaginresten, samtidigt som asparaginet på proteinet omvandlas till asparaginsyra efter enzymatisk hydrolys.
När al-6-fukos är lokaliserad vid GlcNAc-kärnan, kan PNGas F också skära; endast när α1-3-fukos finns vid GlcNAc-kärnan (vanligt i växt- och insektsglykoproteiner), kan PNGas F inte skära.
Den konventionella PNGase F enzymatiska reaktionen kräver dock flera timmar för att frisätta antikroppar N-glykaner, och på grund av preferensen för glykanfrisättning kan ofullständig deglykosylering leda till partiska resultat, och den erhållna glykanfördelningen kanske inte representerar den korrekta sammansättningen av terapeutiska antikroppar. Att erhålla en korrekt N-glykanprofil så snabbt som möjligt är därför avgörande för glykosyleringsövervakning under produktionsprocessen av antikroppar och antikroppsfusionsproteiner och andra bioterapeutiska medel.
Snabb PNGase F
Fast PNGase F är ett optimerat rekombinant reagens som snabbt och fullständigt kan deglykosylera antikroppar, immunglobuliner, fusionsproteiner och andra glykoproteiner på några minuter. Detta enzym kan snabbt och utan preferens ta bort alla N-glykaner och kan direkt användas för kromatografi nedströms eller masspektrometrianalys. Yeasen Fast PNGase F, N-glykosidas F (Fast Version) förenklar experimentprocessen, minskar experimenttiden samtidigt som känslighet och repeterbarhet säkerställs.
Produktegenskaper:
Snabb: Fullständig och snabb deglykosylering på några minuter.
Hög renhet: Inget proteas, glykosidaskontamination, renhet ≥95%.
Icke-selektiv: Ta bort alla N-glykaner snabbt och utan preferens.
Bra kompatibilitet: Används direkt för nedströms kromatografi eller masspektrometrianalys.
Testdata:
Enstegs proteindeglykosylering:
- 10 ug substrat/100 ug antikropp och ddH2O blandat till en total volym av 16 ul;
- Tillsätt 4 μL Fast PNGase F-buffert (5x), slutvolym 20 ul;
- Tillsätt 1 μL Fast PNGase F.
- Inkubera vid 50°C i 10 minuter.
Figur 2. En-stegs enzymatisk klyvningseffekt på proteinsubstrat (A) och antikropp (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Konkurrent + substrat eller antikropp 3: Konkurrent + substrat eller antikropp 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrat eller antikropp 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Konkurrent
Tvåstegs proteindeglykosylering:
- 10 ug substrat/100 ug antikropp och ddH2O blandat till en total volym av 16 ul;
- Tillsätt 4 μL Fast PNGase F-buffert (5x), slutvolym 20 ul;
- Inkubera vid 80°C i 2 minuter, kyl till rumstemperatur.
- Tillsätt 1 μL Fast PNGase F.
- Inkubera vid 50°C i 10 minuter.
Figur 3. Enzymatisk klyvningseffekt i två steg på proteinsubstrat (A) och antikropp (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: Konkurrent + substrat eller antikropp 3: Konkurrent + substrat eller antikropp 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrat eller antikropp 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Konkurrent
Slutsats:
- Yeasen Fast PNGase F har samma eller högre enzymatiska klyvningseffektivitet som importerade konkurrenter under samma reaktionsbetingelser;
- Det rekommenderas att utföra en enzymatisk klyvning i två steg för att säkerställa högre effektivitet i enzymatisk klyvning. Vissa antikroppar (såsom Fab N-glykosylering) kräver ett förvärmningssteg
för effektiv deglykosylering.
Dessutom Yeasen tillhandahåller även vanligt PNGase F(Cat#20407ES, specifik aktivitet: 100000 U/mL) och andra typer av glykosidaser, såsom Endo H glykosidas H (Cat#20414ES), Endo S glykosidas S (Cat#20413ES).
Köpguide
| Produktumber | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Produktnamn | Snabb PNGase F | PNGase F | Endo H | Endo S |
| Källa | Jäst rekombinant uttryck | Jäst rekombinant uttryck | Jäst rekombinant uttryck | E.coli rekombinant uttryck |
| Specifik aktivitet | Ej tillämpligt | 100 000 U/ml | 1000000 U/ml | 8000 U/mg |
| Klyvningsplats | Nästan alla N-länkade glykaner | Nästan alla N-länkade glykaner | N-länkade hög mannosglykaner | Klyver inom kärndisackaridstrukturen av IgG tung kedja |
| Matsmältningstid | 10 min | 1-3 timmar | 1-3 timmar | 1 h |
| Glykosylering | Lämplig | Lämplig | Lämplig | Lämplig |
| Proteinstruktur | Lämplig | Lämplig | Lämplig | Lämplig |
beställningsinformation
| Produktnamn | Produktnummer | Specifikation |
| 20406ES20/50 | 20 T/50 T | |
| 20407ES01/02 | 15000 U /75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U /50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1 000 U/5 x 1 000 U |