När det kommer till telomerer och Protelomeras inom biologi tänker människors sinnen ofta först på åldrande, ett oundvikligt naturfenomen. Telomerer är repetitiva DNA-sekvenser i ändarna av eukaryota kromosomer, som bär ansvaret för att upprätthålla kromosomintegriteten och reglera celldelningscykeln.
Protelomeras är ett DNA-syntesenzym för omvänt transkriptas som förlänger telomerer. Det är ett nukleoprotein som består av RNA och proteiner. Proteinkomponenten kan katalysera syntesen av telomerupprepningssekvenser med RNA-komponenten.
Figur 1. Mekanism för protelomerasmedierad telomerförlängning[1]
Protelomeras kan reparera och förlänga telomerer, kompensera för defekter i DNA-replikation, förhindra telomerförlust under celldelning och öka antalet celldelningar. År 2009 tilldelades Nobelpriset i fysiologi eller medicin till Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider och Jack W Szostak för deras enastående insatser i att avslöja telomerernas och protelomerasens avgörande roll. i cellulär funktion och åldrande.
Idag vill jag presentera ett unikt Protelomeras: TelN proProtelomeras. TelN Protelomeras kommer från bakteriofag N15 och är en komponent i N15-replikationssystemet, som deltar vid generering av linjärt profag-DNA. Till skillnad från Protelomerase i eukaryoter är TelN ett rent proteinenzym utan några RNA-komponenter. Den har klyvning-ligering aktivitet och lämnar en kovalent sluten ände vid klyvningsstället efter skärning av dubbelsträngat DNA (dsDNA).
Figur 2. TelN Protelomeras Klyvningsplats
TelN Protelomeras Verkningsmekanism
Igenkänningsplatsen för TelN Protelomerase är en palindromsekvens som är 56 bp lång, med telR och telL på båda sidor. Den centrala positionen för målsekvensen är också en palindromsekvens telO. TelN Protelomeras klyver inom telO-sekvensen och bildar en kovalent sluten hårnålsstruktur vid de två klyvningsändarna. Slutet av DNA:t efter digestion består fortfarande av telR och telL, vilket är känt som doggybone DNA (dbDNA).
Figur 3. Protelomeras klyvningsmekanism vid TelN-stället[2]
På grund av den speciella enzymklyvnings-ligeringsaktiviteten hos TelN Protelomerase kan cirkulär plasmid-DNA omvandlas till linjära kovalent slutna hantelformade molekyler genom en en-stegs enzymatisk reaktion. Jämfört med linjära öppna DNA-molekyler har linjär stängd DNA högre proteinuttrycksnivå i celler, vilket är mycket lämpligt för att konstruera linjär sluten mini-DNA med hög stabilitet och minimal främmande sekvens. Plasmid-DNA spelar en viktig roll som kärnelementet i mRNA-vaccin, DNA-vaccin och cellgenterapi. Den traditionella plasmidproduktionsmetoden innebär fermentering med E. coli och flerstegsförstärkning, och den okontrollerbara risken i fermenteringsprocessen begränsar utbytet av högkvalitativ plasmid, vilket blir nyckeln till att begränsa produktionskapaciteten för vacciner. Touchlight-företaget i Storbritannien har lanserat en innovativ dbDNA-teknik. Denna teknologi stör den traditionella metoden för bakteriell fermentering för plasmid-DNA-framställning och istället för att använda in vitro enzymatisk syntes av DNA. Den speciella enzymklyvnings-ligeringsaktiviteten hos TelN Protelomerase används också för att generera linjärt mini-DNA med sluten ände i ovanstående metod.
Tillämpning av TelN Protelomerase i DNA Enzymatic Synthesis
Enzymatisk DNA in vitro metod baserad på phi29 DNA polymeras och TelN Protelomerase kan undvika många okontrollerbara risker i den biologiska jäsningsprocessen, och den in vitro enzymatiska metoden kan syntetisera DNA med snabb hastighet och högt utbyte. Det syntetiserade DNA:t kan användas i många nya teknologier, såsom mRNA-vaccin, DNA-vaccin, genterapivektor och genredigering.
Figur 4. Flödesschema över DNA-enzymatisk syntes[3]
Enzymatisk DNA-syntesprocess
- Mall denaturering
Den cirkulära plasmid-DNA-mallen omvandlas till två enkelsträngade cirkulära DNA genom en denatureringsprocess.
- Rullande cirkelförstärkning
Rullande cirkelamplifiering utfördes genom att använda Phi29 DNA-polymeras och enkelsträngat cirkulärt DNA för att generera långt linjärt dubbelsträngat konkatemert DNA med protesomerasigenkänningssekvensintervall.
- Skärning och kovalent stängning
TelN Protelomerase känner igen telRL på DNA från telomera komplex och utför klyvningsligeringsaktiviteter för att generera linjära, kovalent anslutna DNA-monomerer.
- Avlägsnande av bakteriellt ryggrads-DNA
Restriktionsendonukleaser eller exonukleaser bryter ner bakteriens skelett-DNA med en öppen struktur i änden för att erhålla DNA som endast innehåller målgenexpressionselementen. Enzymatisk syntes av DNA-teknologi kringgår biologisk fermentering och kan snabbt uppnå GMP-nivå plasmid-DNA-syntes, vilket löser produktionskapacitetsbegränsningarna inom områdena genterapi och mRNA-vacciner. Det har en enorm potential för industrialisering. För att främja utvecklingen av DNA-enzymatisk syntesteknologi kan YEASEN Biology tillhandahålla kärnenzymmaterial för DNA-enzymatisk syntes, såsom phi29 DNA-polymeras (14404ES) och TelN Protelomerase (14540ES), för att hjälpa till med forskning och produktion av DNA-enzymatisk syntesteknologi.
Pprestationspresentation av YEASEN TelN Protelomeras
- Klyvnings-ligationsprestanda är utmärkt, vilket motsvarar importerade märken.
Med användning av en superlindad plasmid innehållande TelN Protelomerase-igenkänningsstället som mall, tillsattes gradientadditionsenzymet (0,078-5 U) från YEASEN och märke A. 0,5 μg supercoiled plasmid omvandlades till slutet linjärt dubbelsträngat DNA (dsDNA). Gelelektrofores användes för att detektera omvandlingseffektiviteten, och resultaten visade att klyvnings- och ligeringsaktiviteten för YEASENs TelN Protelomerase var ekvivalent med den för varumärke A.
Figur 5. Protelomerasklyvningsaktivitet detektion av TelN M:Marker, C: supercoiled plasmidkontroll
- Stängningsintegriteten för linjärt dsDNA > 90 %
Använda den supercoiled plasmiden som innehåller TelN Protelomerase igenkänningsställe som mall, lägga till TelN Protelomerase av YEASEN och varumärke A, omvandla 0,5 μg supercoiled plasmid till slutet linjärt dsDNA och lägga till T5 exonukleas för att detektera dess slutintegritet genom bandnedbrytningsgrad. Resultaten visade att dsDNA-slutförslutningsintegriteten som genererades av TleN Protelomerase från YEASEN var > 90 %, vilket var likvärdigt med märke A.
Figur 6. Integritetstest för TelN Protelomerase-ändförslutning. Cl: plasmid innehållande TelN igenkänningsställe, utan TelN Protelomeras; C2: plasmid innehållande TelN igenkänningsställe, TelN Protelomeras, utan T5 exonukleas; Plasmid: plasmid som innehåller TelN-igenkänningsställe.
Relaterade produkter av DNA-enzymatisk syntes
| Produktklassificering | Produktnamn | Katalog nr. |
| Protelomeras | 14540ES | |
| Phi29 DNA-polymeras | 14404ES | |
| Exonukleas | Exonukleas III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rreferenser
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomer och Protelomeras biologi. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linjärt stängt mini-DNA som genereras av det prokaryota klyvningssammanfogande enzymet TelN är funktionellt i däggdjursceller. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linjär sluten mini-DNA som genereras av det prokaryota klyvningssammanfogande enzymet TelN är funktionellt i däggdjursceller. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.