Restriktionsendonukleaser från Yeasen FuniCut™-serien, 5 minuters matsmältning med universalbuffert
Molekylär kloning används i nästan alla laboratorier. Restriktionsendonukleaser är en avgörande komponent i molekylära kloningsexperiment, men människor besväras också ofta av olika problem med restriktionsendonukleasexperiment. Vanliga problem är följande:
- Det finns så många typer av restriktionsendonukleaser att det är svårt att välja.
- Missklyvning, slumpmässig klyvning eller ofullständig enzymatisk klyvning.
- Matsmältningshastigheten är trög; det kan ta en timme eller till och med över natten.
- Dessutom måste multipla enzymsmältningsexperiment också välja en mängd olika enzymsmältning bTo
För att visa dig en mer grundlig förståelse av restriktionsendonukleaser kommer följande kortfattat förklara vad restriktionsendonukleaser är och hur olika endonukleaser klassificeras som svar på den första frågan. Yeasen FuniCut™-serien av snabba restriktionsendonukleaser kan lätt lösa det andra till det fjärde problemet genom stammodulering och en förbättrad procedur!
1. Vad är restriktionsendonukleas?
2. Begränsningar av endonukleasnomenklatur
3. Restriktioner för endonukleasklassificering
4. Yeasen FuniCut™ snabba restriktionsendonukleaser
1. Vad är restriktionsendonukleas?
Restriktionsendonukleaser är en klass av enzymer som kan känna igen specifika nukleotidsekvenser i dubbelsträngade DNA-molekyler och klippa fosfodiesterbindning i DNA-kedjor på specifika ställen.
Olika restriktionsendonukleaser kommer att känna igen olika DNA-sekvenser. De kan skära DNA inuti igenkänningssekvensen eller på en plats inte långt från igenkänningssekvensen, vilket resulterar i olika produkter, som illustreras i figur 1. BamHI bildar klibbiga ändar, KpnI bildar 3'ticky ändar och EcoRV bildar trubbiga ändar.
Figur 1. Schematiskt diagram av BamHI, KpnI, EcoRV digestion
2. Begränsningar endonukleasnomenklatur
Släktets namn, artnamn, bakteriestam eller serotyp och upptäcktsordningen är de primära faktorerna som används för att namnge restriktionsendonukleaser. Namnriktlinjerna visas i tabell 1 nedan med BstEII som exempel:
Tabell 1. Begränsningar endonukleasnomenklatur
| Förkortning | Fullständigt namn | Inblandning |
| B | Bacill | Första bokstaven i släktnamnet |
| st | stearothermophilus | De två första bokstäverna i artnamnet |
| E | ET | Första bokstaven i stamnamnet |
| II | Andra upptäckten | Ordningen som finns i sådana bakterier |
3.Restriktioner för endonukleasklassificering
Beroende på strukturens komplexitet, verkningssättet och skillnaden mellan kofaktorerna kan restriktionsenzymer delas in i fyra kategorier. Följande tabell 2 sammanfattar egenskaperna och typiska enzymer för varje kategori.
Tabell 2. Variationerna mellan flera restriktionsendonukleaser
| Endonukleas klass | Drag | Typiska enzymarter |
| Typ I | 1. Klyvning av igenkänning och modifiering. 2. Den kan känna igen specifika DNA-sekvenser, och matsmältningsstället är på obestämd tid borta från igenkänningsstället, upp till tusentals baser. 3. Åtgärd kräver ATP. | EcoB, EcoK, etc. |
| Typ II | 1. Har endast funktionen att identifiera skärning. 2. Igenkänningssekvensen är ofta en kort palindromisk sekvens (cirka 4–8 bp), och det specifika digestionsstället för restriktionsendonukleaset är vanligtvis den igenkända sekvensen. 3. Åtgärd kräver Mg2+. 4. Typen av restriktionsenzymer som oftast används vid molekylär kloning. | HindIII, NotI, etc. |
| Typ III | 1. Igenkänning och modifiering matsmältning. 2. Separera om igenkänningsstället från matsmältningsstället. 3. Åtgärder kräver ATP. | HinfIII et al. |
| Typ IV | 1. Klipper endast metylerade DNA-sekvenser. 2. Cirka 30 bp separerar igenkänningsstället från matsmältningsstället. | McrA, McrBC, etc. |
Som anges i tabell 3 nedan kan den också delas upp i tre grupper baserat på likheterna och skillnaderna mellan igenkännings- och nedbrytningsställena.
Tabell 3.Jämförande analys av Isoschizomer, Neoschizomer och Isocaudarner
|
| Isoschizomer | Neoschizomer | Isocaudarner |
| igenkänningssekvens | samma | samma | olik |
| matsmältningsställen | samma | olik | samma |
| typisk representant | AgeI och BshTI: båda känner igen och klyver 5′-A↓CCGGT-3′ | SmaI (5'-CCC↓GGG-3′) och XmaI(5'-C↓CCGGG-3′) | BamHI (5'-G↓GATCC-3') och BglII (5'-A↓GATCT-3') |
Med tanke på det faktum att vissa restriktionsendonukleaser på marknaden fortfarande kräver matsmältning över natten, och produkterna är benägna att få felaktig matsmältning, slutför Yeasen Fast Restriction Endoa nukleas, en universell buffert, exakt matsmältning på 5 minuter, vilket gör att dina matsmältningsexperiment inte längre får problem!
4. Yeasen FuniCut™ Snabba restriktionsendonukleaser
Figur 2. Yeasen FuniCut™ snabba restriktionsendonukleaser
4.1 Funktioner
- Snabb rötning: rötningen kan avslutas på 5–15 minuter, vilket kan reduceras med mer än 1-2 timmar jämfört med konventionella rötningsexperiment.
- Universell buffert: Multienzymklyvningsreaktionen görs enklare av det faktum att vilken kombination av endonukleas som helst kan använda samma buffert.
- Effekt av enzymdigestion: jämförbar med N* och lämplig för dess buffert.
- Direkt elektrofores gör processen enklare genom att tillhandahålla en röd färgbuffert och tillåta att rötningsprodukterna levereras direkt för elektrofores.
- Exakt matsmältning: Även med matsmältning över natten finns det väldigt lite stjärnaktivitet.
4.2 Utställning av föreställning
4.2.1 I FuniCut™ Buffer sker enkel, dubbel och trippel digestion på 5 minuter.
Figur 3. Enkel, dubbel och trippel digestion med FuniCut™ Buffert kan vanligtvis vara färdigt på 5 minuter, till exempel trippeluppslutningen med EcoRI+KpnI+SmaI.
4.2.2 Effekten av enzymnedbrytningen är jämförbar med N* och T*, och den fungerar bra med deras buffertar.
Figur 4. Jämfört med liknande N*, T*-varor är Yeasen FuniCut™ BamHI-enzymsmältningseffekten kompatibel med N*, T*-märkta buffertar.
4.2.3 Matsmältning över natten med mycket låg stjärnaktivitet
Figur 5. Använd de snabba endonukleaserna HindIII, Nhel, PstI, Xbal och XhoI från Yeasen, Tbydance med det experimentella protokoll som rekommenderas av varje märke.Utför en matsmältning över natten (16 timmar) och analysera de smälta produkterna med hjälp av agarosgelelektrofores.
4.2.4 Mycket redundant och kan hantera en del överskottssubstrat.
Figur 6. Med FuniCut™ Fast Restriction Endonukleas EcoR I, Eag I, Xbal och Sac I användes 1 μg respektive 1,5 μg plasmid som substrat och spjälkades i 5 minuter, och de digererade produkterna utsattes för agarosgelelektrofores.
Tabell 4.Kompatibilitet med produkter och reaktionsbuffert
| Produktnamn | Katt# | Igenkänningssekvens | Temperatur | Termisk deaktiveringstemperatur |
| T*-buffert | N* buffert | Ta* buffert | Skyddad bas (bp) | Svar |
| FuniCut™ AscI (fråga) | 15001ES50 | GG/CGCGCC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| FuniCut™ AvrII (fråga) | 15002ES25 | C/CTAGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25T |
| FuniCut™ BamHI (fråga) | 15003ES76 | G/GATCC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 500T |
| FuniCut™ BclI (fråga) | 15004ES62 | T/GATCA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 125T |
| FuniCut™ BsaI (fråga) | 15005ES50 | GGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | Inte | 50T |
| FuniCut™ BstEII (fråga) | 15006ES60 | G/GTNACC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | Inte | 100T |
| FuniCut™ ClaI (fråga) | 15007ES50 | AT/CGAT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| FuniCut™ DpnII (fråga) | 15008ES50 | /GATC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | Inte | 50T |
| FuniCut™ EagI (fråga) | 15009ES25 | C/GGCCG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ EcoRI (fråga) | 15010ES78 | G/AATTC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 600T |
| FuniCut™ EcoRV (fråga) | 15011ES70 | GAT/ATC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 200T |
| FuniCut™ HindIII (fråga) | 15012ES76 | A/AGCTT | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 500T |
| FuniCut™ HpaI (fråga) | 15013ES50 | GTT/AAC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 1 | 50T |
| FuniCut™ KpnI (fråga) | 15015ES70 | GGTAC/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 200T |
| FuniCut™ MluI (fråga) | 15016ES60 | A/CGCGT | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 100T |
| FuniCut™ NcoI (fråga) | 15018ES30 | C/CATGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30T |
| FuniCut™ NdeI (fråga) | 15019ES70 | CA/TATG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200T |
| FuniCut™ NheI (fråga) | 15020ES30 | G/CTAGC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30T |
| FuniCut™ NotI (fråga) | 15021ES50 | GC/GGCCGC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| FuniCut™ PstI (fråga) | 15022ES76 | CTGCA/G | 37 | Inga | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 500T |
| FuniCut™ SacI (fråga) | 15023ES60 | GAGCT/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 100T |
| FuniCut™ SalI (fråga) | 15024ES70 | G/TCGAC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200T |
| FuniCut™ SbfI (fråga) | 15025ES25 | CCTGCA/GG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ SmaI (fråga) | 15027ES60 | CCC/GGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100T |
| FuniCut™ Spel (fråga) | 15028ES50 | A/CTAGT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| FuniCut™ SphI (fråga) | 15029ES50 | GCATG/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| FuniCut™ SspI (fråga) | 15030ES56 | AAT/ATT | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 60T |
| FuniCut™ StuI (fråga) | 15031ES60 | AGG/CCT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100T |
| FuniCut™ TaqI (fråga) | 15032ES70 | T/CGA | 65 | Inga | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| FuniCut™ XbaI (fråga) | 15033ES76 | T/CTAGA | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 500T |
| FuniCut™ XhoI (fråga) | 15034ES76 | C/TCGAG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 500T |
| FuniCut™ FspI (fråga) | 15036ES50 | TGC/GCA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 50T |
| FuniCut™ HinfI (fråga) | 15038ES76 | G/ANTC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 500T |
| FuniCut™ ApaLI (fråga) | 15039ES70 | G/TGCAC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| FuniCut™ NruI (fråga) | 15040ES50 | TCG/CGA | 37 | Inga | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 50T |
| FuniCut™ PacI (fråga) | 15041ES25 | TTAAT/TAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ PvuII (fråga) | 15042ES70 | CAG/CTG | 37 | Inga | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| FuniCut™ SacII (fråga) | 15043ES50 | CCGC/GG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| FuniCut™ NsiI (fråga) | 15044ES25 | ATGCA/T | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25T |
| FuniCut™ Esp3I (BsmBI) (fråga) | 15048ES30 | CGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 30T |
| FuniCut™ BglII (fråga) | 15049ES60 | A/GATCT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 100T |
| FuniCut™ BstBI (fråga) | 15050ES60 | TT/CGAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | Inte | 100T |
| FuniCut™ MnlI (fråga) | 15051ES50 | CCTC(7/6) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
CpG: Påverkas av CpG-metylering.
EK: Påverkad av EcoKI-metylering.
EB: Påverkad av EcoBI-metylering.
Dcm: Påverkad av Dcm-metylering.
Dam: Påverkad av Dam-metylering.