- Bakgrund
Uppgifterna som sammanfattas i denna rapport är utförda av Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. för MycAwayTM Mycoplasma realtids qPCR-detektionskit (2G) produkt.
Sammanfattningsdata är endast för användarens referens, och användaren måste verifiera mykoplasmametoden genom att använda sina egna prover för att bekräfta att metoden kan uppfylla användarens krav. Alla laboratorier som använder detta kit rekommenderas att verifiera följande parametrar: Detektionsgräns, Specificitet och Robusthet.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. kan tillhandahålla den detaljerade kvalificeringsrapporten för detta kit. Om användaren använder denna rapport bör endast lämpligheten (som inkluderade detektionsgräns och specificitet) verifieras.
Valideringsinnehåll:
| Prestanda | Valideringsparametrar | Valideringsresultat |
| Detektionsgräns | Gränsvärde för detektion av mykoplasmastam | Detektionsgräns för 10 typer av farmakopeiell mykoplasma: 10 CFU/ml, var och en testad 24 gånger med en detektionsgrad på ≥95%. |
| Specificitet | Exempel på matrixinterferens | Testade 9 olika provmatriser och DNA-spädningslösningar, ingen mykoplasma upptäckt. |
| Korsreaktivitet | Testade 14 stammar och 6 vanligt använda ingenjörsceller i bioläkemedel, ingen mykoplasma upptäckt. | |
| Varaktighet | Frys-tina stabilitet | Klarar 20 upprepade frys-upptiningscykler utan att påverka satsens prestanda. |
| Termisk accelerationsstabilitet | Opåverkad under förhållanden på 37°C i 14 dagar och 4°C i 30 dagar. | |
| Instrumentkompatibilitet | Kompatibel med ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 och Roche LightCycler®480. | |
| Rapportering | Täckning av Mycoplasma DNA-typer | Databasjämförelse med mycoplasma 16S rRNA-sekvenser täcker 183 arter inom klassen Mollicutes. |
- Experimentella material och metoder
2.1 MycAwayTM Mycoplasma realtids qPCR-detektionskit (2G), leverantör: Yeasen, Kat.nr.: 40619ES60.
2.2 MolPureTM Förberedelsesats för magnetiskt DNA-prov, leverantör: Yeasen, Kat.nr.: 18461ES60.
2.3 Mycoplasma-känslighetsstandarderna köps från Minerva Biolabs (MB), vars stammar är från National Collection of Type Cultures (NCTC). Känslighetsstandarderna är inaktiverad mykoplasma och används för metodologisk verifiering av nukleinsyraamplifieringsmetod (qPCR/PCR-metod) för mykoplasmadetektion. Totalt 10 typer av mykoplasma köps in som inkluderar kraven i EP 2.6.7 och JP G3. Informationen om standarderna är följande:
| Försäljare | Katt nr. | NCTC nr. | ATCC Inga. | Materialnamn |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma arginini |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma orale | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma pneumoniae | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10CFU™ Känslighetsstandard Acholeplasma laidlawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ Känslighetsstandard Spiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10CFU™ Känslighetsstandard Mycoplasma salivarium |
2.4 Originaldata: den elektroniska versionen registrerades i "Experimental Report" underfilen till den överordnade filen 'MycAwayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G)'.
2.5 Metoder: Materialen och operationsmetoderna som användes för experimentet producerades eller sattes i princip av Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., som utvärderades och verifierades under lång tid, utvecklingen och tillverkningen av kitet följs enligt ISO 13485-systemet.
- Kvalifikationens innehåll och resultat
3.1 Detektionsgräns (LOD)
Nukleinsyraextraktion såväl som detektion av 10 CFU/ml Mycoplasma standardstammen utfördes enligt instruktionerna för standardstammen såväl som instruktionerna för extraktions- och detektionssatsen. Totalt 24 analyser erhölls för 10 CFU/ml Mycoplasma standardstammen. NCS (Negative Control Sample) och NTC (No Template Control) prover testades samtidigt i varje experiment.
Resultaten visade att NCS- och NTC-resultaten var tillfredsställande, och alla 24 10 CFU/mL-prover testade positiva, vilket uppfyllde kravet på att ha minst 23 positiva resultat av 24 tester.
| Inga. | Materialnamn | Koncentration av bakteriell vätska |
| 1 | Mycoplasma arginini | 10 CFU/ml |
| 2 | Mycoplasma orale | 10 CFU/ml |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 CFU/ml |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae | 10 CFU/ml |
| 5 | Mycoplasma synoviae | 10 CFU/ml |
| 6 | Mycoplasma fermentans | 10 CFU/ml |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 CFU/ml |
| 8 | Akoleplasma laidlawii | 10 CFU/ml |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 CFU/ml |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 CFU/ml |
Tabell 1 Information om validerade stammar
| 10 CFU/ml | Experiment 1 | Experiment 2 | Experiment 3 |
| Detektionshastighet | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Total | 24/24 | ||
Tabell 2 Detektionsgränsresultat
3.2 Specificitet
3.2.1 Mycoplasma testområde
Primerprobsekvenserna i kitet jämfördes med 16S rRNA-genomet i databasen. Genom bioinformatikanalys erhölls att MycAwayTM Mycoplasma qPCR-detektionskit (probmetod) av NextSense Biologicals kan täcka minst 183 arter av Zooxanthellae, inklusive 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma och 7 Cholestrongyla, och så vidare.
3.2.2 Provmatrisinterferens
9 substrat (Dulbecco's MEM, Ham's F-10 Medium, M-199 Medium, Ham's F-12K Kaighn's, RPMI-1640 Medium, McCoy's 5A, Ham's F-12K Kaighn's+1.0mM/L Glutamine, L-15 .05 mM L-Glutamin, DMEM-lågglukos standardmedium) används som prover för att verifiera provmatrisinterferensen, resultaten visade att mediet inte har någon interferens med kit-reagenserna.
3.2.3 Flexibacteria detektionsområde
Extraktion och detektion av inaktiverad mycoplasma (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma citri och Mycoplasma citri, Mycoplasma citri, Mycoplasma 1 och CFUCS1 salivarium krävs) NTC provtestning.
Resultaten visade att NCS och NTC inte upptäcktes och resultaten var negativa; alla 10 mykoplasmaarter upptäcktes och resultaten var positiva.
3.2.4 Korsreaktion
För 14 icke-flexibakteriella stammar inklusive Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), ett antal andra vanliga bacillus-coccus-bakterier (Stfungiphylococcus-mikroorganismer, epidemiphylococcus, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) användes för mykoplasmadetektion med hjälp av MolPureTM Magnetisk pärlmetod för resterande DNA-provförbehandlingskit (flaskor) och MycAwayTM Mycoplasma qPCR Detection Kit (Probe Method) (2G), och varje experiment utfördes samtidigt med PCS, NCS och NTC provtestning.
Resultaten visade att PCS-, NCS- och NTC-resultaten var tillfredsställande; testproverna var negativa och ingen korsreaktivitet inträffade.
3.3 Robusthet
3.3.1 Frys-tina stabilitet
Mycoplasma-testsatsen utsattes för frys-tinningsexperiment under betingelserna -25℃~-15℃, och resultaten visade att satsen kunde motstå 20 gånger upprepad frysning och upptining, och dess prestanda påverkades inte.
3.3.2 Accelererad stabilitet
Mycoplasma-detektionssatsen värmeaccelererades vid 37 ℃ i 14 dagar respektive vid 4 ℃ i 30 dagar, och resultaten visade att produktens prestanda inte påverkades.
3.3.3 Instrumenttillämpning
För mycoplasma-detektionssatsen användes olika koncentrationer av positiv kontroll och Mycoplasma pneumoniae-DNA i kitet som prover som skulle testas, och experimenten utfördes på fyra olika märken och modeller, nämligen Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S, respektive Roche0 Cycler® 48.Experimenten utfördes på qPCR-instrument från fyra olika märken och modeller, Shanghai Hongshi SLAN-96S och Roche LightCycler®480.
Resultaten visade att proverna som skulle testas detekterades på qPCR-instrument av olika tillverkares modeller och de negativa kontrollresultaten var kvalificerade och satsens prestanda påverkades inte.
- 4.Hänvisning
4.1 Mykoplasma undersökningsmetod <3301>. Kinesisk farmakopé, del III [S]. Peking: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Riktlinjer för validering av analysmetoder <9101>. Kinesisk farmakopé, del III [S]. Peking: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Riktlinjer för validering av alternativa metoder för mikrobiologisk testning av läkemedel <9201>. Kinesisk farmakopé, del III [S]. Peking: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Mykoplasma. Europeiska farmakopén[S]. 10:e upplagan, 2020: Avsnitt 2.6.7, 194-199.
4.5 Mykoplasmatester för cellsubstrat som används för produktion av biotekniska/biologiska produkter <G3-14-170>. Japanska farmakopén[S]. 18:e upplagan, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J. Graham, et al. Effekter på produktkvalitetsattribut för monoklonala antikroppar som produceras i CHO-cellbioreaktorkulturer under avsiktliga mykoplasmakontaminationshändelser. Bioteknik och bioteknik. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Mykoplasmatester av cellsubstrat och biologiska läkemedel: Genomgång av alternativa icke-mikrobiologiska tekniker. Mol Cell Probes. 2011 apr-jun;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. En PCR-detektionsmetod för att testa Mycoplasma-kontamination av veterinärvacciner och biologiska produkter. Låta in tillämpad mikrobiologi. 2015 feb;60(2):174-180.
Beställningsinformation
| Beskrivning | Artikelnummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detektionskit (2G) | 40619ES |